梁秀妹 周子寒 林秋伶 周先果 劉穎春 溫秋萍 向邦德余紅平

作者單位：530021 南寧 1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院疾病流程管理辦公室；3廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；4廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部；5廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科

原發(fā)性肝癌是全球發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一。據(jù)估計，2018年全世界新發(fā)肝癌病例數(shù)達84.1萬例，死亡人數(shù)達78.2萬例［1］，其中，中國新發(fā)病例數(shù)及死亡病例數(shù)約占50%，而廣西是我國肝癌的高發(fā)地區(qū)［2］。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的類型，約占90%。研究表明，乙型肝炎病毒感染是我國HCC發(fā)生的最主要危險因素，約85%的HCC患者存在乙型肝炎病毒感染［3］。巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期對HCC 的治療有指導(dǎo)作用［4-5］。臨床上可應(yīng)用BCLC分期對HCC患者進行分類，并針對不同患者采取不同的治療方法。

機體抗腫瘤免疫由細(xì)胞免疫與體液免疫二者共同參與［6］。機體的免疫水平與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。既往研究表明，HCC患者中的細(xì)胞免疫功能受到抑制，如外周血T淋巴細(xì)胞亞群失衡［7］；而HCC患者的體液免疫功能增強，如免疫球蛋白、補體、C-反應(yīng)蛋白（C-reaction protein，CRP）等體液免疫因子在血清中高富集［8-10］。陳佳佳［11］發(fā)現(xiàn)隨著BCLC分期的升高，患者血清CD8+T細(xì)胞、CD4+/CD8+T比值等細(xì)胞免疫因子隨著發(fā)生變化，提示細(xì)胞免疫水平可能與腫瘤的進展密切相關(guān)。王亮等［12］發(fā)現(xiàn)隨著肝癌Child-Pugh分級的增高，患者血清補體C3和C4水平降低。上述研究提示細(xì)胞免疫和體液免疫狀況因肝癌的分期不同而改變，可用于判斷病情的進展并為免疫治療提供依據(jù)［13］。因此，本研究旨在分析HCC患者中細(xì)胞免疫和體液免疫狀況與BCLC分期的相關(guān)性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月—2017年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院入院治療的HCC初治患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴病理確診為HCC；⑵未接受過任何形式的抗腫瘤治療；⑶有明確的BCLC分期診斷；⑷接受體液免疫功能和細(xì)胞免疫功能的檢查；⑸乙型肝炎病毒感染患者，即其乙肝表面抗原陽性。排除有糖尿病、高血壓、甲亢、HIV感染和肺部感染等免疫系統(tǒng)疾病史者。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均知情同意。患者入院后第1天空腹抽取外周靜脈血3 mL，3 000 r/min離心5 min待測。所有標(biāo)本均在血液樣品收集完成后2 h內(nèi)檢測。

1.2 免疫比濁法測定體液免疫因子的水平

免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、補體C3、補體C4和CRP等體液免疫因子水平均通過免疫比濁法測定，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作，試劑盒由浙江夸克生物技術(shù)公司提供，檢測儀器為西門子ADVIA2400全自動生化分析儀，由德國西門子公司生產(chǎn)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫因子的水平

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者CD3+T淋巴細(xì)胞（總T細(xì)胞）、CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞（Th細(xì)胞）、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞（Ts細(xì)胞）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和B細(xì)胞的水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 3.5.2和SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若滿足方差齊性，組間計量資料的比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗；若不滿足方差齊性，組間比較采用韋爾奇檢驗（Welch test），多重比較采用Games-Howell檢驗。采用Spearman檢驗分析免疫因子和BCLC分期的相關(guān)性。以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同BCLC分期HCC患者間體液免疫和細(xì)胞免疫的差異分析

本研究共納入1 164例HCC患者，其中BCLC分期A期393例，B期210例和C/D期561例。表1顯示，性別、肝硬化背景在不同BCLC分期之間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而年齡在不同分期HCC患者間的分布無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。HCC患者體液免疫中IgG、IgA、C3、C4和CRP在不同BCLC分期中的水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。其中相比于A期或B期的患者，C/D期患者中IgG、IgA、C3、C4和CRP水平均增高（均 P<0.05）；而 IgG、IgA、C3、C4和CRP在A期和B期患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05），見圖1。在HCC患者細(xì)胞免疫中，總T細(xì)胞在不同BCLC分期中的水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.040），其中，相比于B期患者，C/D期患者中的總T細(xì)胞水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；相比于A期，C/D期患者中的總T細(xì)胞水平降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。Spearman相關(guān)分析顯示，IgG、IgA、C3、C4和CRP 水平與 BCLC分期呈正相關(guān)，而總T細(xì)胞水平與BCLC分期無關(guān)（P>0.05）。

表1 HCC患者中細(xì)胞免疫和體液免疫在不同BCLC分期間的差異分析Tab.1 The differences in cell and humoral immunity status among different BCLC stage of HCC patients

圖1 HCC患者中不同BCLC分期免疫因子的差異分析Fig.1 The differences in immunity factors among different BCLC stage of HCC patients

2.2 性別分層下體液免疫和細(xì)胞免疫與BCLC分期的關(guān)系

表2結(jié)果顯示，在男性HCC患者中，不同BCLC分期患者的 IgG、IgA、C3、C4、CRP和總 T 細(xì)胞的分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）；而在女性HCC患者中，不同BCLC分期患者間僅有C3和CRP的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 肝硬化史分層下體液免疫和細(xì)胞免疫與BCLC分期的關(guān)系

表3結(jié)果顯示，無論在無肝硬化或有肝硬化的HCC中，不同分期患者間的IgG、IgA、C3、C4和CRP的分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。在有肝硬化的HCC中，不同分期患者的總T淋巴細(xì)胞含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而在無肝硬化的HCC中，總T細(xì)胞數(shù)與BCLC分期無關(guān)（P>0.05）。

表2 性別分層下不同BCLC分期HCC患者的體液免疫和細(xì)胞免疫的差異分析Tab.2 The differences between humoral and cellular immunity in different BCLC stage of HCC patients stratified by gender

表3 肝硬化背景分層下不同分期BCLC的HCC患者的體液免疫和細(xì)胞免疫的差異分析Tab.3 The differences between humoral and cellular immunity in different BCLC stage of HCC patients stratified by cirrhosis background

3 討論

成熟T細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞，主要分為Th細(xì)胞和Ts兩個亞群。Th細(xì)胞主要可以調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞的免疫應(yīng)答并協(xié)助B細(xì)胞分泌抗體，Ts為細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞，參與殺傷腫瘤細(xì)胞的過程，Th/Ts值可維持機體細(xì)胞免疫功能的穩(wěn)定。既往研究表明，CD3+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等淋巴細(xì)胞亞群含量在HCC中降低［14］，可能促進腫瘤細(xì)胞的增殖，加重病情并導(dǎo)致患者預(yù)后不良。在本研究中，C/D期HCC患者的T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，尤其低于B期患者。但在分層分析中，男性、有肝硬化的HCC患者中，不同BCLC分期的T淋巴細(xì)胞總數(shù)存在差異；而女性、無肝硬化的HCC患者中的T淋巴細(xì)胞總數(shù)與BCLC分期之間無相關(guān)性。以上結(jié)果提示細(xì)胞免疫功能不僅與BCLC分期有關(guān)，還與患者的性別、肝硬化背景密切相關(guān)。

血清免疫球蛋白IgG、IgA和IgM等是機體重要的免疫效應(yīng)因子，IgA在機體抗感染的第一道防御中起重要作用；IgG可促進吞噬細(xì)胞吞噬病原體，還具備活化補體的功能，是人體含量最高的免疫球蛋白。IgM可通過激活補體，促進吞噬作用，在早期感染中發(fā)揮重要免疫防御作用。王烈等［15］發(fā)現(xiàn)，TNM分期Ⅱ期的HCC患者中的免疫球蛋白IgA、IgM、IgG水平高于TNM分期Ⅰ期的HCC患者，提示HCC患者的TNM分期越高，其體液免疫功能越紊亂。在本研究中，IgG和IgA水平隨BCLC分期增高而升高，但其變化受到性別因素的影響。在男性HCC患者中，不同BCLC分期的IgG、IgA水平存在差異，而在女性患者中未發(fā)現(xiàn)IgG、IgA水平與BCLC分期的有關(guān)。提示HCC患者的血清免疫球蛋白水平與BCLC分期密切相關(guān)，特別是男性患者。

補體C3、C4是抗原-抗體免疫復(fù)合物反應(yīng)中的重要因子，主要由肝臟合成，其活性與肝功能關(guān)系密切。張金彥等［16］研究發(fā)現(xiàn)HCC患者的血清補體C3水平高于乙型肝炎肝硬化組患者。周曉萍等［17］研究發(fā)現(xiàn)相比于健康對照組，C3水平和C4水平在HCC患者均升高。在本研究中，C3、C4水平隨BCLC分期的增高而升高，不受患者性別、肝硬化背景等特征的影響。上述結(jié)果提示隨著BCLC分期的增高，患者體內(nèi)補體增加，可能是由于患者體液免疫增強或者補體消耗受阻造成的。

CRP是機體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥刺激時肝細(xì)胞合成的一種炎癥反應(yīng)因子。既往研究表明，在大多數(shù)惡性腫瘤患者中CRP水平升高，CRP高水平與惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)［18-20］。CRP可用于HCC或肝臟良性疾病的診斷和鑒別，有助于臨床評估腫瘤發(fā)展進程，對患者的治療和預(yù)后起重要作用［8，21-22］。王濤等［23］發(fā)現(xiàn)HCC患者TNM分期越高CRP水平增高，且隨著分化程度的升高，CRP水平降低。在本研究中，在不同臨床特征人群中均可以觀察到BCLC分期C/D期HCC患者中CRP水平高于A、B期患者，提示機體CRP水平不受患者性別、肝硬化背景等特征的影響，隨著腫瘤分期的增加而升高，其原因可能為BCLC分期增高，患者的肝組織損傷加重，從而導(dǎo)致CRP增加。

綜上所述，隨著BCLC分期的增加，HCC患者的體液免疫功能增加，而細(xì)胞免疫功能受到抑制。此外，不同BCLC分期HCC患者的體液免疫和細(xì)胞免疫水平，可能受到性別、肝硬化背景等因素的影響。對HCC患者進行免疫功能檢測，并結(jié)合患者BCLC分期等臨床特征可更好地了解HCC患者的病情，為患者預(yù)后評估以及免疫治療提供參考依據(jù)。