王志杰 栗曉東 田亮 張強(qiáng) 董路玲 寧建峰 霍占江

作者單位：075000 張家口 張家口市第一醫(yī)院1耳鼻咽喉頭頸外科，2內(nèi)分泌科，3檢驗(yàn)科

甲狀腺癌是常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌是其常見(jiàn)的病理類(lèi)型，約占甲狀腺癌的80%～85%［1］。甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后良好，病死率低，但易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，具有較高的局部復(fù)發(fā)和癌癥特異性死亡風(fēng)險(xiǎn)［2-3］。因此，早期識(shí)別和監(jiān)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌有重要意義。細(xì)胞角蛋白-20（cytokeratin-20，CK-20）是上皮細(xì)胞和上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞的重要成分。研究報(bào)道CK-20高表達(dá)于膀胱癌和結(jié)腸癌腫瘤組織及血液中，并與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。半乳糖凝集素4（galectin-4，LGALS4）是半乳糖凝集素家族的重要成員，在結(jié)直腸癌、胰腺癌等細(xì)胞中高表達(dá)，廣泛參與細(xì)胞凋亡、增殖及腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生理病理過(guò)程［6-7］。此外，網(wǎng)站（http：//www.coexpedia.org/index.php）核酸分析顯示，LGALS4與CK-20在非小細(xì)胞肺癌、食管癌、胰腺癌等多種腫瘤中共表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及炎癥反應(yīng)過(guò)程［8］。但是 CK-20、LGALS4在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明確。本研究檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20、LGALS4表達(dá)，并分析其診斷及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值，以期為甲狀腺乳頭狀癌的臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2014年6月于張家口市第一醫(yī)院接受手術(shù)且經(jīng)組織病理證實(shí)的128例甲狀腺乳頭狀癌患者為研究對(duì)象，收集術(shù)后癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織石蠟包埋標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合甲狀腺乳頭狀癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；⑵術(shù)前無(wú)手術(shù)史及放化療等抗腫瘤治療；⑶無(wú)內(nèi)分泌相關(guān)疾病病史及嚴(yán)重心腦血管疾病；⑷臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并其他惡性腫瘤患者；⑵合并全身免疫性疾病、肝臟疾病及腎臟疾病患者；⑶碘劑治療后6～12個(gè)月獲得血清甲狀腺球蛋白和甲狀腺球蛋白自身抗體者；⑷妊娠期女性。所有患者均為高分化癌；其中男性34例；平均年齡（45.4±4.2）歲（范圍：20～70歲）；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；TNM分期［10］：Ⅰ期53例，Ⅱ期42例，Ⅲ期22例，Ⅳ期11例。本研究經(jīng)張家口市第一醫(yī)院道德倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，采用免疫組化En Vision兩步法檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中CK-20、LGALS4的表達(dá)，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。兔抗人LGALS4多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abnova公司，兔抗人CK-20單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物制劑有限公司。

免疫組化染色結(jié)果由3名病理科的專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行獨(dú)立閱片。CK-20、LGALS4主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，均以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。采用Remmele半定量法［11］對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比評(píng)分：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）；著色強(qiáng)度評(píng)分：0分（無(wú)著色或著色不清），1分（淺黃色），2分（棕黃色），3分（深褐色）；染色指數(shù)（SI）為陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分乘積，以SI＜2為陰性表達(dá)，SI≥2為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 隨訪

患者治療后通過(guò)門(mén)診復(fù)查方式隨訪，記錄患者無(wú)病生存期（disease-free survival，DFS）。DFS 定義為術(shù)后至首次出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或由疾病進(jìn)展導(dǎo)致死亡的時(shí)間。隨訪前3年每6個(gè)月隨訪1次，之后每年隨訪1次，隨訪截至2019年11月30日，中位隨訪時(shí)間為27個(gè)月。隨訪期間，29例（22.66%）復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；19例（14.84%）死亡；其中9例死于甲狀腺乳頭狀癌，10例死于心血管疾病或意外等其他原因；無(wú)失訪病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類(lèi)資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Spearman等級(jí)相關(guān)分析甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20表達(dá)水平與LGALS4表達(dá)水平相關(guān)性；受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析 CK-20、LGASL4對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的診斷價(jià)值；采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間生存曲線比較采用Log-rank檢驗(yàn)；多因素Cox回歸分析影響患者DFS的因素。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CK-20、LGALS4在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織（85.9% vs 25.0%，χ2=96.213，P＜0.001），見(jiàn)圖 1；LGALS4 陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常組織（32.8% vs 89.8%，χ2=87.771，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖1 CK-20在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（×400）Fig.1 The expression of CK-20 in papillary thyroid carcinoma tissues and adjacent normal tissues（×400）

圖2 LGALS4在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)（×400）Fig.2 Expression of LGALS4 in papillary thyroid carcinoma tissues and adjacent normal tissues（×400）

2.2 CK-20、LGALS4表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關(guān)系

甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20、LGALS4表達(dá)水平均與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05），未發(fā)現(xiàn)其與患者性別、年齡有關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表1。Spearman相關(guān)分析顯示，CK-20與LGALS4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.531，P＜0.001）。

2.3 CK-20、LGALS4對(duì)甲狀腺乳頭狀癌的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CK-20、LGALS4及兩者聯(lián)合診斷甲狀腺乳頭狀癌的曲線下面積分別為0.840（95% CI：0.788～0.892，P＜0.001）、0.785（95% CI：0.727～0.843，P＜0.001）、0.938（95% CI：0.912～0.964，P＜0.001），敏感度分別為85.9%、67.2%、100.0%，特異度分別82.0%、89.8%、71.9%。CK-20、LGALS4聯(lián)合診斷甲狀腺乳頭狀癌的曲線下面積優(yōu)于CK-20、LGALS4（Z=3.270，P=0.001；Z=4.680，P＜0.001）。見(jiàn)圖 3。

2.4 甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20、LGALS4表達(dá)水平與患者DFS的關(guān)系

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，甲狀腺乳頭狀癌患者5年DFS為70.3%；CK-20陽(yáng)性表達(dá)患者5年DFS低于CK-20陰性表達(dá)患者（66.36% vs 94.44%，Logrank χ2=5.027，P=0.025）；LGALS4 陽(yáng)性表達(dá)患者5年DFS高于LGALS4陰性表達(dá)患者（85.71% vs 62.79%，Log-rank χ2=7.644，P=0.006），見(jiàn)圖 4。

表1 甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20、LGALS4表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship of CK-20 and LGALS4 expression in papillary thyroid carcinoma tissues with clinicopathological features［n（%）］

圖3 CK-20、LGALS4診斷甲狀腺乳頭狀癌的ROC曲線Fig.3 ROC curves of CK-20 and LGALS4 in diagnosis of papillary thyroid carcinoma

2.5 影響甲狀腺乳頭狀癌患者DFS的Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析顯示，CK-20高表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及LGALS4高表達(dá)與患者DFS有關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表2；多因素Cox回歸分析顯示，CK-20高表達(dá)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，LGALS4高表達(dá)是患者DFS的保護(hù)因素（均 P＜0.05），見(jiàn)表 3。

圖4 CK-20、LGALS4陽(yáng)性與陰性表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌患者的Kaplan-Meier生存曲線Fig.4 Kaplan-Meier survival curves for papillary thyroid carcinoma patients with CK-20，LGALS4 positive and negative expression

表2 影響甲狀腺乳頭狀癌患者DFS的單因素分析Tab.2 Univariable analysis of affecting DFS in papillary thyroid carcinoma patients

表3 影響甲狀腺乳頭狀癌患者DFS的多因素分析Tab.3 Multivariable analysis of affecting DFS in papillary thyroid carcinoma patients

3 討論

CK-20是一種低分子量細(xì)胞角蛋白，具有上皮組織特異性，其表達(dá)大多局限于胃腸道上皮、尿路上皮細(xì)胞和Merkel細(xì)胞中，且在腫瘤組織及血液中表達(dá)升高。研究發(fā)現(xiàn)，CK-20 mRNA高表達(dá)于甲狀腺乳頭狀癌、濾泡型甲狀腺癌、未分化型甲狀腺癌的腫瘤組織和外周血中，并與腫瘤TNM分期、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可作為判斷甲狀腺癌分期的標(biāo)志物［12］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中CK-20陽(yáng)性表達(dá)在不同T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度、腫瘤大小和臨床分期中均存在明顯差異，且CK-20陽(yáng)性表達(dá)對(duì)肺癌患者的生存結(jié)局有不利影響［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常甲狀腺組織，且CK-20高表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示CK-20可能作為促癌因子參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CK-20診斷甲狀腺乳頭狀癌的曲線下面積為0.840，敏感度為85.9%，特異度為82.0%，提示CK-20在甲狀腺乳頭狀癌診斷中具一定價(jià)值。此外，本研究中CK-20陽(yáng)性表達(dá)患者5年DFS低于陰性表達(dá)患者，且CK-20高表達(dá)是DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CK-20高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良，在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

LGALS4是一種多功能外源性凝集素，可參與免疫調(diào)節(jié)、血管生成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MAFTOUH等［14］在胰腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)LGALS4高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移。曾金華等［15］亦發(fā)現(xiàn)LGALS4在巨大肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織和正常肝組織，且LGALS4低表達(dá)與巨大肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌組織中LGALS4陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁正常甲狀腺組織，且其低表達(dá)與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LGALS4可能作為抑癌因子參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LGALS4診斷甲狀腺乳頭狀癌的曲線下面積為0.785，敏感度為67.2%，特異度為89.8%，提示LGALS4在甲狀腺乳頭狀癌中雖具一定診斷價(jià)值，但敏感度較低，需考慮與其他指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)以提高診斷價(jià)值。此外，本研究中LGALS4陽(yáng)性表達(dá)患者5年DFS高于陰性表達(dá)患者，且LGALS4高表達(dá)是DFS的保護(hù)因素，提示LGALS4高表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好。

本研究還發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20與LGALS4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且多因素分析結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與武元元等［16］研究結(jié)果一致。因此推測(cè)兩者可能協(xié)同參與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移進(jìn)程，結(jié)合ROC曲線分析結(jié)果證實(shí)CK-20、LGALS4聯(lián)合診斷甲狀腺乳頭狀癌的效能均優(yōu)于其單項(xiàng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌組織中CK-20與LGALS4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CK-20高表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良，LGALS4高表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好，兩者聯(lián)合檢測(cè)有助于提高診斷效能，兩者有望成為監(jiān)測(cè)甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后的生物標(biāo)志物。但本研究樣本量較小，CK-20、LGALS4與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系仍有待驗(yàn)證，二者相互作用的機(jī)制亦需進(jìn)一步研究。