孟天宇,劉英丹,婁永江

(寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315211)

二氧化氯是一種廣譜殺菌劑,在使用過程中無殘留、無毒害,同時(shí)可有效地殺滅大多數(shù)微生物,對(duì)芽孢、病毒和寄生蟲等均有很好地殺滅作用[1]。然而ClO2性質(zhì)活潑,在空氣中的濃度超過10%時(shí)有爆炸危險(xiǎn),且受熱、受光照容易發(fā)生分解或氧化[2]。為克服二氧化氯氣體的使用局限性,人們開始研究固體二氧化氯緩釋劑。

土倉滿[3]最初用合成樹脂吸附ClO2水溶液,制成吸附性二氧化氯固體,后又用硬脂酸、蛋白質(zhì)骨膠等做硅膠替換合成樹脂。Fujita[4]將亞氯酸鈉、硅藻土和聚丙烯酸類樹脂等按照一定比例混合,制成反應(yīng)型二氧化氯固體緩釋劑。周大軍等[5]將穩(wěn)定的ClO2高濃度溶液噴灑于固態(tài)多孔性硅膠中,制成一種二氧化氯固體緩釋劑。但固體二氧化氯緩釋劑主要存在著殺菌時(shí)間短、二氧化氯濃度不可控的問題,從而導(dǎo)致食品中的一些芽孢、孢子等無法被殺滅,在食品儲(chǔ)藏中后期容易變質(zhì)。同時(shí),GB 2760-2014規(guī)定穩(wěn)定態(tài)ClO2做防腐劑時(shí)最大使用量不超過50 mg/kg,初始ClO2濃度過高時(shí),不符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)。

因此,為了解決上述問題,本研究篩選不同種類活化劑、凝膠劑及氯鹽,研究其對(duì)二氧化氯緩釋劑緩釋效果的影響,尋找最佳配比,旨在找到一種濃度可控、有效殺菌時(shí)間長、防腐效果優(yōu)良的ClO2緩釋劑,且降低殺菌劑對(duì)食品本身氣味的干擾,將固體二氧化氯更好地應(yīng)用于食品中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞氯酸鈉 薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;草酸、DL-酒石酸、乙二胺四乙酸、氯化鈉、滑石粉(800目) America VWR International;氯化鈣、氯化鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硅藻土、海藻酸鈉、可得然膠、卡拉膠、明膠 通化安柏生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

PFS-200型大功率手壓封口機(jī) 東莞市青葉包裝機(jī)械有限公司;XLA-BX-CLO2型便攜式氣體檢測儀 深圳市普利通電子科技有限公司;Sigma 3k15型冷凍干燥機(jī) 德國希格瑪公司;QUANTA-200型掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 長效二氧化氯緩釋劑的制備 先稱取10 g硅膠,一定量的亞氯酸鈉和水,按比例混合均勻后得到懸濁液A,并將凝膠劑、氯鹽和水混合均勻得到混合物B。然后將二者混合均勻,得到甲劑。接著,稱取8.5 g硅膠,一定量的活化劑和水按照一定比例混合均勻,再加入粘合劑(22 g滑石粉)攪拌均勻,得到乙劑。進(jìn)一步將甲乙兩劑混合,得到二氧化氯保鮮劑固體。如圖1所示。

圖1 二氧化氯保鮮劑制備流程圖Fig.1 Flowchart of preparation of chlorine dioxide preservative

1.2.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽種類的篩選

1.2.2.1 活化劑種類的選擇 在保持18 g NaClO2用量一致的前提下,分別選擇草酸(H2C2O4)、酒石酸(TA)和乙二胺四乙酸(EDTA)各1.8、3.0、5.8 g,選取可得然膠20 g,氯化鈉15 g,制備二氧化氯保鮮劑。并在25 ℃,相對(duì)濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設(shè)置5次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數(shù)占比 。

1.2.2.2 凝膠劑種類的選擇 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸用量一致的前提下,分別稱取20 g硅藻土(DE)、海藻酸鈉(SA)、可得然膠(CUD)、卡拉膠(CAR)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、明膠(GEL),選取氯化鈉15 g,制備二氧化氯保鮮劑,并在25 ℃,相對(duì)濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設(shè)置5次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數(shù)占比 。

1.2.2.3 氯鹽種類的選擇 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸,20 g羧甲基纖維素鈉,用量一致的前提下,分別稱取46.8、44.4 g氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2),制備二氧化氯保鮮劑,并在25 ℃,相對(duì)濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設(shè)置5次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數(shù)占比 。

1.2.3 活化劑、凝膠劑及氯鹽配方探究

1.2.3.1 活化劑、凝膠劑及氯鹽用量的確定 根據(jù)1.2.2的初步篩選,確定最佳的活化劑為乙二胺四乙酸、凝膠劑為羧甲基纖維素鈉,氯鹽為氯化鈉。在羧甲基纖維素鈉10 g、氯化鈉21 g不變的條件下,分別取5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g乙二胺四乙酸,且根據(jù)亞氯酸鈉與氫離子的反應(yīng)方程確定亞氯酸鈉的量;在乙二胺四乙酸2 g、氯化鈉21 g不變的條件下,分別取8、12、16、20、24 g羧甲基纖維素鈉;在乙二胺四乙酸2 g、羧甲基纖維素鈉10 g不變的條件下,取7、14、21、28、35 g氯化鈉;根據(jù)1.2.1中的方法制備二氧化氯緩釋劑,并在25 ℃,相對(duì)濕度90%,體積0.4 m3的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行緩釋,每組設(shè)置5組平行實(shí)驗(yàn)。比較每組實(shí)驗(yàn)中二氧化氯氣體濃度,選擇合適的活化劑、凝膠劑及氯鹽的用量。

1.2.3.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽質(zhì)量比的確定 在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上,以氯化鈉(A)、乙二胺四乙酸(B)、羧甲基纖維素鈉(C)為考察因素,采取正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響提取的上述主要因素進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化,如表1,記錄二氧化氯氣體濃度的變化規(guī)律,并計(jì)算其有效殺菌天數(shù)占比。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 ClO2氣體濃度檢測 稱取2.0 g制得的二氧化氯保鮮劑固體,置于6 cm×8 cm滅菌后的無紡布透氣型包裝袋中并封口,然后將其放置于12 cm×18 cm密封袋中并封口。每天隨機(jī)抽取每組樣品5份,用ClO2氣體檢測儀檢測密封袋中的ClO2氣體濃度,共觀察33 d。

1.2.5 ClO2緩釋速率計(jì)算 每個(gè)樣品緩釋出的二氧化氯氣體濃度降至1 mg/kg時(shí),對(duì)大多微生物已不具有殺滅效果,故設(shè)置1 mg/kg為本研究中的最低有效濃度。ClO2緩釋快慢程度,以降至1 mg/kg的時(shí)間的倒數(shù)V來表示,單位d-1。V越小,T越大,保鮮劑釋放二氧化氯氣體越緩慢,有效期越長。

式中:V表示ClO2緩釋的快慢程度,d-1;T表示ClO2氣體濃度降至1 mg/kg時(shí)所需要的時(shí)間,d。

1.2.6 有效殺菌天數(shù)占比 本研究中,有效殺菌天數(shù)占比(c)為ClO2氣體濃度在1～50 mg/kg的天數(shù)(d)與總檢測天數(shù)(D)的比值,用來表現(xiàn)緩釋劑的殺菌效果。有效殺菌天數(shù)占比(c)越大,說明該保鮮劑緩釋過程中,濃度不超過50 mg/kg且不低于1 mg/kg的時(shí)間越長。

1.2.7 二氧化氯緩釋劑內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征觀察 取緩釋1 d的緩釋劑和緩釋15 d的緩釋劑各1 g,放入2 mL圓底離心管,冷凍干燥48 h后取出,制成粉末狀。用導(dǎo)電膠將樣品粉末粘于樣品臺(tái)上,噴金,置于環(huán)境掃描電鏡下[6-7],先在低倍下進(jìn)行觀察,然后在高倍下,觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次,采用描述統(tǒng)計(jì)、方差分析等處理方式,通過Origin 8.0(版本號(hào):8.932.0.932)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化劑、凝膠劑及氯鹽的確定

圖2 不同活化劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.2 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different activators

如圖2所示,三種緩釋劑的緩釋速度相近,即釋放出的二氧化氯氣體的濃度低至1 mg/kg的時(shí)間相近,這是因?yàn)檎麄€(gè)體系中可以發(fā)生反應(yīng)的亞氯酸鈉總量有限。乙二胺四乙酸(EDTA)做活化劑時(shí),緩釋劑的有效殺菌時(shí)間占比最大,比草酸做活化劑時(shí)提高了18%,比酒石酸做活化劑時(shí)提高了20%,在緩釋過程中濃度在1～50 mg/kg的時(shí)間多于其他兩種。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇乙二胺四乙酸為活化劑。

2.1.2 凝膠劑的確定 凝膠劑的微孔結(jié)構(gòu)既可以吸附產(chǎn)生的ClO2氣體,減緩ClO2的擴(kuò)散速率,使ClO2氣體緩慢地釋放,又可以使包裹有NaClO2的硅膠均勻分布,從而降低整個(gè)反應(yīng)過程中活化劑的弱酸離子的遷移速度,降低NaClO2的反應(yīng)速率。

硅藻土(DE)內(nèi)部結(jié)構(gòu)多孔,可利用本身的負(fù)電性和吸附性吸附硅膠和NaClO2[8];海藻酸鈉(SA)持水力強(qiáng),有利于硅膠、NaClO2的附著[9-10];可得然膠(CUD)粘合性較好[11],可以將包裹發(fā)生劑的硅膠離子吸附至自身的孔洞中;卡拉膠(CAR)中陰離子性硫酸酯基團(tuán)可以與游離水分子結(jié)合[12],使卡拉膠具有良好的吸水性,其他反應(yīng)物分子也可進(jìn)入其凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中[13];羧甲基纖維素鈉(CMC)是由纖維素改性得到的大分子聚合物,具有很好的粘結(jié)力和持水力[14];明膠(GEL)在加熱條件下,可形成凝膠混合物,使其他成分能夠均勻的分布在明膠膠網(wǎng)絡(luò)中[15]。故本研究選用這六種凝膠劑,分別制備二氧化氯保鮮劑并測量其二氧化氯氣體濃度,比較二氧化氯氣體緩釋速率和有效殺菌天數(shù)占比,如圖3所示。

圖3 不同凝膠劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.3 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different gels

如圖3所示,羧甲基纖維素鈉(CMC)的緩釋速度最低,有效殺菌時(shí)間占比最大,是因?yàn)镃MC的粘結(jié)力和持水力較好,能均勻地粘結(jié)二氧化氯亞氯酸鈉、硅膠及氯鹽,保持了甲劑的均一性[16]。硅藻土(DE)和明膠(GEL)的緩釋速度較大,這是因?yàn)榧尤牍柙逋習(xí)r,由于硅藻土的負(fù)電性,大量含有亞氯酸鈉的硅膠離子被吸附,同時(shí)硅藻土呈弱酸性[17],一部分硅藻土表面的H+及硅羥鍵和NaClO2發(fā)生反應(yīng)[18],產(chǎn)生大量的二氧化氯氣體;明膠在緩釋過程中能發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),形成緩釋層,而且可在不同pH環(huán)境下形成不同電性的離子,干擾離子場的形成及活化劑中弱酸離子的遷移[19]。加入可得然膠(CUD)制得的緩釋劑有效殺菌時(shí)間占比最低,因?yàn)榭傻萌荒z需在加熱條件下,可形成高強(qiáng)度凝膠[20],在本研究中部分反應(yīng)物未能與凝膠完全結(jié)合。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇羧甲基纖維素鈉為凝膠劑。

2.1.3 氯鹽的確定 在反應(yīng)中加入凝膠劑后,部分活化劑和亞氯酸鈉被阻隔。加入氯鹽,可以在電勢電位的作用下形成微電場[26],使帶正電荷的弱酸在該環(huán)境下逐漸向微孔網(wǎng)絡(luò)凝膠中遷移,與NaClO2接觸產(chǎn)生ClO2氣體。同時(shí)氯鹽多為不發(fā)生反應(yīng)的中性鹽,可以起到鈍化劑的作用,阻隔反應(yīng)物直接接觸。為此本研究選擇了NaCl和CaCl2兩種氯鹽,比較二氧化氯氣體緩釋速率和有效殺菌天數(shù)占比,如圖4所示。

圖4 不同活化劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.4 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different chlorine salt

如圖4所示,加入氯化鈣的緩釋劑的有效殺菌天數(shù)占比明顯低于氯化鈉作氯鹽的緩釋劑,這是因?yàn)镃aCl2在提供電子的同時(shí),也起到了吸濕劑的作用,CaCl2潮解[27]使保鮮劑中水分增加,反應(yīng)物融合充分[28],反應(yīng)更劇烈而達(dá)不到緩釋的目的。所以,本實(shí)驗(yàn)選擇氯化鈉。

2.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽用量對(duì)二氧化氯氣體濃度影響的結(jié)果

將分別加入8、12、16、20、24 g羧甲基纖維素鈉制得的緩釋劑,標(biāo)記為CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4、CMC-5組,記錄其二氧化氯氣體濃度,濃度如圖5a所示。五組試驗(yàn)中的二氧化氯氣體濃度整體呈下降趨勢,其中CMC-2組的初始濃度和最大濃度最低,第33 d時(shí)的濃度仍大于1 mg/kg。減少CMC的量到8 g(CMC-1組)時(shí),其初始濃度略高于第二組;增加到16 g(CMC-3組)時(shí),其初始濃度大于第二組且遠(yuǎn)超50 mg/kg 的濃度標(biāo)準(zhǔn)。所以該實(shí)驗(yàn)中,加入羧甲基纖維素鈉最佳范圍為8～12 g。

將分別加入5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g的乙二胺四乙酸制得的緩釋劑,標(biāo)記為EDTA-1、EDTA-2、EDTA-3、EDTA-4、EDTA-5組,如圖5b所示。前4組緩釋劑釋放出的二氧化氯氣體濃度呈先上升后下降趨勢。其中第3組緩釋劑的最高濃度小于國家標(biāo)準(zhǔn)要求且有效殺菌時(shí)間較長。第5組由于酸含量過少,亞氯酸鈉可能未完全反應(yīng),導(dǎo)致產(chǎn)生二氧化氯氣體過少,有效緩釋時(shí)間短。所以該實(shí)驗(yàn)中,加入乙二胺四乙酸2 g最佳。

分別取7、14、21、28、35 g氯化鈉制得的緩釋劑,標(biāo)記為NaCl-1、NaCl-2、NaCl-3、NaCl-4、NaCl-5組,如圖5c所示。5組緩釋劑在第33 d時(shí)的濃度均大于1 mg/kg,其中二氧化氯緩釋濃度整體較低且有效殺菌時(shí)間最長的為第4組。所以該實(shí)驗(yàn)中,加入氯化鈉28 g最佳。

圖5 活化劑、凝膠劑及氯鹽對(duì)二氧化氯氣體濃度的影響Fig.5 Effects of activator,gel and chlorine salt on the concentration of chlorine dioxide

2.3 長效二氧化氯緩釋劑最優(yōu)配方比的確定

2.3.1 配方優(yōu)化安排及結(jié)果分析 在2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇NaCl為氯鹽,EDTA為活化劑,CMC為凝膠劑,按照表1,對(duì)影響提取的上述主要因素進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化,采用正交表L9(34)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn),如表2所示。本正交試驗(yàn)的誤差值小(0.02),數(shù)據(jù)可信。A、B、C三個(gè)因素的R值和空白列誤差相比差異明顯。三個(gè)因素對(duì)ClO2緩釋過程的影響力依次為:NaCl>CMC>EDTA,影響最大的是NaCl,綜合考慮確定最佳方案為CMC∶EDTA∶NaCl=14∶1∶5。

表2 配方優(yōu)化結(jié)果分析表Table 2 Formula optimization analysis

2.3.2 配方優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 在25 ℃,相對(duì)濕度50%環(huán)境下,按優(yōu)化后的配比,設(shè)置5組平行實(shí)驗(yàn),記錄ClO2氣體濃度隨時(shí)間的變化情況,如圖6所示,優(yōu)化后的緩釋劑釋放出的二氧化氯氣體最高濃度不超過50 mg/kg,有效殺菌天數(shù)28 d,占比84.85%。

圖6 二氧化氯氣體濃度變化Fig.6 Change of chlorine dioxide concentration

2.3.3 不同緩釋天數(shù)對(duì)二氧化氯緩釋劑內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征的影響 在電鏡下,放大650、1500、3000倍，分別觀察緩釋1 d和緩釋15 d的保鮮劑的內(nèi)部結(jié)構(gòu),如圖7所示。配方優(yōu)化后的二氧化氯緩釋劑內(nèi)部為致密的微孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),顆粒排列緊密且有一定規(guī)則。緩釋劑中90%以上的微孔小于10 μm,圖7a為剛開始釋放ClO2的緩釋劑內(nèi)部結(jié)構(gòu),圖7b為緩釋15 d后的二氧化氯緩釋劑的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。比較兩圖可以看出,緩釋劑的內(nèi)部形態(tài)與緩釋時(shí)間有關(guān),1 d時(shí),緩釋劑剛開始反應(yīng)并釋放二氧化氯氣體,內(nèi)部微孔排列較緊密。15 d時(shí),緩釋劑內(nèi)部微孔數(shù)量增加且孔隙略大,反應(yīng)產(chǎn)生的二氧化氯氣體儲(chǔ)存在微孔結(jié)構(gòu)中并緩慢釋放到環(huán)境中。

圖7 二氧化氯緩釋劑內(nèi)部結(jié)構(gòu)Fig.7 Internal structure of chlorine dioxide sustained-release agent

3 結(jié)論

本研究研發(fā)了一種殺菌防腐效果佳,濃度可控制在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的ClO2緩釋劑,將緩釋型二氧化氯更好地應(yīng)用于食品保鮮中。研究發(fā)現(xiàn)選用EDTA為活化劑,可使有效殺菌時(shí)間延長20%;選用羧甲基纖維素鈉(CMC)為凝膠劑時(shí),二氧化氯氣體緩釋速率最小且有效殺菌時(shí)間較長;選用NaCl為氯鹽,提供微電場環(huán)境的同時(shí)能鈍化反應(yīng)物。當(dāng)CMC、EDTA和NaCl的質(zhì)量比為14∶1∶5時(shí),得到的保鮮劑的有效殺菌時(shí)間(濃度為1～50 mg/kg的時(shí)間)達(dá)28 d。在電鏡下觀察優(yōu)化后的保鮮劑,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)為致密的微孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),顆粒排列緊密且有一定規(guī)則,反應(yīng)產(chǎn)生的二氧化氯氣體可儲(chǔ)存在緩釋劑的微孔結(jié)構(gòu)中并實(shí)現(xiàn)緩慢釋放。

本研究著重研發(fā)了緩釋時(shí)間1個(gè)月左右的ClO2緩釋劑。若想將二氧化氯更廣泛的應(yīng)用于食品保鮮或其他領(lǐng)域中,就需要進(jìn)一步研究更有效的凝膠劑、鈍化劑或其他緩釋材料,或開發(fā)新型的包裝材料和包裝方式,使緩釋劑有效期更長。