董世榮,徐 微,李 欣,孫 宇

(1.哈爾濱學(xué)院食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150086;2.哈爾濱學(xué)院食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150086)

膠原蛋白是動物體內(nèi)的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在形成器官和維持細(xì)胞完整性等方面起到至關(guān)重要的作用[1]?；谀z原蛋白具有促進(jìn)鈣吸收、保護(hù)極性酒精性胃黏膜、修復(fù)化學(xué)肝損傷等方面的功效,其在食品、醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[2-5]。由于膠原蛋白獨(dú)特三股螺旋結(jié)構(gòu)消化吸收困難[2],經(jīng)酶修飾后得到的膠原蛋白肽吸收利用程度高、乳化性強(qiáng)[6],可被應(yīng)用于酸奶等乳制品中。酸奶是一種以牛乳為原料經(jīng)過乳酸菌(嗜熱鏈球菌和保加利亞桿菌)發(fā)酵而成的乳制品[7],因其具有很高的營養(yǎng)價(jià)值、獨(dú)特的風(fēng)味和保健功能而受到廣大消費(fèi)者喜愛。目前酸奶市場前景廣闊、競爭激烈,如何提高產(chǎn)品的品質(zhì)成為占據(jù)市場競爭優(yōu)勢的關(guān)鍵[8]。

評價(jià)酸奶品質(zhì)的指標(biāo)主要有質(zhì)構(gòu)特征、乳清析出率、流變學(xué)特性、感官評價(jià)等。通過控制酸奶中蛋白質(zhì)(肽)的添加、發(fā)酵菌種、加糖量、溫度等可以有效地改善酸奶質(zhì)量。例如,趙強(qiáng)忠等[9]研究發(fā)現(xiàn)適度酶解的大豆蛋白可以促進(jìn)酸奶發(fā)酵,改善酸奶儲藏品質(zhì),而且具有更多的疏水氨基酸和不帶電親水氨基酸的小分子組分作用更顯著。大豆分離蛋白質(zhì)經(jīng)過胰蛋白酶水解后可提高酸乳在儲藏期間的粘度[10]。乳清濃縮蛋白粉的添加可以改善凝固型酸的持水能力、粘彈性等指標(biāo)[11]。不同溫度發(fā)酵的酸奶之間品質(zhì)存在顯著差異,而且在相同溫度下發(fā)酵的無乳糖酸奶和普通酸奶之間的品質(zhì)也存在不同[12]。將膠原蛋白添加至酸奶中可以得出一款品質(zhì)佳、營養(yǎng)價(jià)值高的膠原蛋白酸奶[13-14]。但是目前針對膠原蛋白肽對酸奶品質(zhì)的影響以及如何定量評估其對酸奶品質(zhì)的影響程度并沒有明確。

因此,本研究系統(tǒng)地研究了膠原蛋白肽的添加量對酸奶的持水能力、酸度、pH、質(zhì)構(gòu)特性、發(fā)酵以及微觀結(jié)構(gòu)的影響,并且對膠原蛋白肽添加量對這些指標(biāo)的影響進(jìn)行了歸一化,旨在定量反映膠原蛋白肽對酸奶品質(zhì)影響規(guī)律，為開發(fā)膠原蛋白肽酸奶奠定一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)實(shí)踐生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

深海鱈魚膠原蛋白肽(蛋白質(zhì)含量≥99%,分子肽量1000～3000 Da,分子呈棒狀,由2條α1鏈,1條α2鏈組成,屬于三聚體) 主要為Ⅰ型膠原蛋白肽,河南興源化工產(chǎn)品有限公司;鮮牛奶 符合GB 19301-2010規(guī)定[15],雙城雀巢有限公司;脫脂奶粉 符合GB 19644-2010規(guī)定[16],雙城雀巢有限公司;混合乳酸菌種(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌) 安琪酵母股份有限公司。

CT3食品物性測定儀 美國Brookfield公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;Allegra64R centrifuge型離心機(jī) 德國Beckman公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;DK-98上海數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津泰斯特有限公司;GJB30-40實(shí)驗(yàn)室高壓均質(zhì)機(jī) 惠合機(jī)械設(shè)備有限公司;YP202N電子天平 上海精密儀器科學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酸奶制備流程 利用鮮牛奶溶解脫脂奶粉,配制蛋白質(zhì)濃度3.5%的原料乳,將原料乳均勻分為10等份,將0.0(即無添加)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%(相對原料乳中蛋白質(zhì)含量的百分比)膠原蛋白肽(Cpa)和50 g/kg(蔗糖質(zhì)量/乳質(zhì)量)的蔗糖分別添加至10份原料乳中。90 ℃殺菌10 min,然后冷卻至發(fā)酵溫度42 ℃,接種0.08 g/kg發(fā)酵菌種,將每份制備樣品平均分裝至3個50 mL滅菌瓶中,42 ℃發(fā)酵8 h后置于4 ℃冰箱24 h,完成酸奶樣品制備[11]。本研究制備的膠原蛋白肽酸奶的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合GB 10302-2010。

1.2.2 持水能力測定 取一定量的酸奶樣品放置已知重量的離心管中,離心管的質(zhì)量記為W,稱取其質(zhì)量W1,然后在4 ℃、1000×g離心力下離心10 min,將上清液去掉,稱去沉淀和離心管的質(zhì)量W2,按照下式計(jì)算酸奶樣品的保水性(WHC)[7]。WHC可表示為:

式(1)

1.2.3 質(zhì)構(gòu)特性測定 基于質(zhì)地多面分析法(TPA)模式[7],在室溫下利用質(zhì)構(gòu)儀測定酸奶樣品的質(zhì)構(gòu)特性,包括硬度(Ha)、粘性(Ad)、彈性(Sp)、膠著性(Gu)、咀嚼性(Ch)和內(nèi)聚性(Co)。測定參數(shù)設(shè)置為:TA4/1000探頭、預(yù)測速度1.0 mm/s、測試前速度2.0 mm/s、測試后速度2.0 mm/s、穿透測試深度30.0 mm、感應(yīng)力大小10.0 g。

1.2.4 pH和滴定酸度(TA)的測定 利用去離子水按照1∶1的比例稀釋酸奶樣品,利用PE28型梅特勒pH計(jì)測定酸奶樣品的pH?；谌樗岬陌俜直壤玫味ǚy定酸奶樣品的滴定酸度[10,17]。利用酚酞作為指示劑,用0.1 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定,測定消耗的NaOH體積(V)。

1.2.5 酸奶發(fā)酵凝固時間的測定 將酸奶樣品瓶傾斜30 °,在開始發(fā)酵后的6、8、10 h,觀察酸奶的凝固狀態(tài)。觀察的狀態(tài)分為未凝固、表面凝固和完全凝固。表面凝固指在發(fā)酵相應(yīng)時間為凝固,但是在傾斜30 °時有液體流動,完全凝固時靜止或者傾斜30 °時均為凝固狀態(tài)。

1.2.6 微觀結(jié)構(gòu)的測定 利用掃描電鏡酸奶樣品的微觀結(jié)構(gòu)[18],具體步驟如下:從表面>10 mm處取4 mm×4 mm×3 mm(長×寬×高)酸奶樣品;將其固定在含有25 g/kg戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH6.8)中24 h(環(huán)境溫度4 ℃);利用0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH6.8)沖洗3次,每次10 min;先后利用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%的乙醇各脫水一次,每次15 min;利用體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇脫水3次,脫水10 min;等體積的100%乙醇和叔丁醇混合溶液脫水1次,脫水10 min,純叔丁醇脫水1次,脫水10 min;冷凍干燥;固定、鍍金;上鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)(25 kV)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0和Statisix 8.1軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量的膠原蛋白肽對酸奶持水能力的影響

如圖1a所示,膠原蛋白肽的添加顯著(P<0.05)影響酸奶的持水能力,酸奶的持水能力隨膠原蛋白肽添加量的增加整體呈上升趨勢,當(dāng)膠原蛋白肽添加量低于0.6%時,持水能力增長快速(76%增長至86%);當(dāng)膠原蛋白肽添加量在0.6%～1.0%時,持水能力變化不明顯(86%～89%),當(dāng)膠原蛋白肽添加量在1.0%～5.0%時,持水能力增長緩慢并逐漸收斂于穩(wěn)定值(92.66%)。蛋白質(zhì)與水相互作用的能力取決于蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基的組成,帶電荷/極性氨基酸與水分子結(jié)合能力較強(qiáng)[19],膠原蛋白肽增強(qiáng)了酸奶中極性或帶電基團(tuán),通過靜電作用提高了酸奶的持水能力[20]。

圖1 膠原蛋白肽添加量對酸奶樣品持水能力(a)的影響和歸一化(b)結(jié)果Fig.1 Effect of the different addition amount of collagen peptide(Cpa)on water holding capacity(WHC,a) and regressed result(b)of generalized WHC(WHCg)of set-style yoghurt

為定量反映膠原蛋白肽添加量對酸奶持水能力的影響規(guī)律,本研究采用ExpDec單指數(shù)函數(shù)擬合歸一化的持水能力(WHCg:添加不同量膠原蛋白肽酸奶樣品持水能力與未添加膠原蛋白肽酸奶樣品平均持水能力的比值,見圖1b),WHCg最小二乘法回歸分析可表示為:

式(2)

本回歸方程反映出膠原蛋白肽添加量與酸奶持水能力呈現(xiàn)單指數(shù)函數(shù)的關(guān)系,可以定量確定在酸奶持水能力達(dá)到目標(biāo)值時膠原蛋白肽的添加量。

2.2 不同添加量的膠原蛋白肽對酸奶酸度和pH的影響

如圖2所示,膠原蛋白肽的添加提高了酸奶的pH,但降低了酸奶的滴定酸度。當(dāng)膠原蛋白肽添加量從0增加至2.0%時,酸奶的pH由4.20快速地線性增長至4.47,而滴定酸度則由131.00 °T迅速地下降至113.67 °T;當(dāng)膠原蛋白肽添加量繼續(xù)從2.0%增加至5.0%時,酸奶的pH略有上升,滴定酸度保持緩慢下降趨勢,最終下降至108.67 °T。pH的上升或滴定酸度的降低說明添加膠原蛋白肽對酸奶中有機(jī)酸的產(chǎn)生具有抑制作用[17]。

圖2 不同添加量膠原蛋白肽酸奶樣品pH和滴定酸度(TA)隨Cpa的變化和歸一化回歸分析Fig.2 Changes of pH value and titratabe acidity(TA)of yoghourt samples and regressed results of generalized pH(pHg),titratabe acidity(TAg)varied with Cpa

為定量地反映膠原蛋白肽的添加對酸奶pH和滴定酸度的影響,本研究分別建立了歸一化pH(pHg)和歸一化滴定酸度(TAg)的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?pHg和TAg最小二乘法回歸結(jié)果可表示為:

pHg=1.15-1.13×0.18Cpa

式(3)

式(4)

pH、滴定酸度與膠原蛋白肽添加量的歸一化公式得出膠原蛋白肽添加量與酸奶pH、持水能力均呈現(xiàn)單指數(shù)函數(shù)的關(guān)系,通過歸一化的公式可以通過調(diào)控膠原蛋白肽的添加量確定酸奶的發(fā)酵程度。

2.3 不同添加量的膠原蛋白肽對酸奶發(fā)酵的影響

如表1所示,膠原蛋白肽的添加延長了酸奶的發(fā)酵時間,添加量越大延時越明顯。酸奶樣品發(fā)酵6 h后,膠原蛋白肽添加量低于0.6%的酸奶樣品表面凝固,膠原蛋白肽添加量高于0.6%的酸奶樣品表面均未凝固;發(fā)酵8 h后,膠原蛋白肽添加量低于0.6%的酸奶樣品完全凝固,膠原蛋白肽添加量在0.8%～2.0%的酸奶樣品表面凝固,膠原蛋白肽添加量大于2.0%的酸奶樣品未凝固;發(fā)酵10 h后,膠原蛋白肽添加量在0.8%～1.0%的酸奶樣品完全凝固,膠原蛋白肽添加量大于2.0%的酸奶樣品未凝固。但是所有的樣品在后熟24 h后均凝固。膠原蛋白肽的添加對酸奶發(fā)酵的影響可能是由于其打破了發(fā)酵菌種聯(lián)合發(fā)酵的平衡[21],也可能是由于其降低了乳中蛋白質(zhì)碰撞交聯(lián)的幾率而延緩酸奶凝膠結(jié)構(gòu)的形成[22]。

表1 酸奶發(fā)酵狀態(tài)隨膠原蛋白肽添加量的變化Table 1 Changes of yoghurt concretionary state as the addition of Cpa

2.4 不同添加量的膠原蛋白肽對酸奶質(zhì)構(gòu)特性的影響

本研究測定的不同添加量膠原蛋白肽的酸奶樣品的硬度(Ha)、粘性(Ad)、彈性(Sp)、膠著性(Gu)、咀嚼性(Ch)和內(nèi)聚性(Co)如圖3所示。膠原蛋白肽的添加明顯改變酸奶的硬度、粘性、膠著性和咀嚼性,隨著膠原蛋白肽添加量增加這4個指標(biāo)整體均呈現(xiàn)衰減趨勢,但膠原蛋白肽的添加對酸奶的彈性和內(nèi)聚性幾無影響。當(dāng)膠原蛋白肽添加量低于2.0%時,硬度、粘性、膠著性、咀嚼性衰減十分迅速,分別由未添加時的236 g、5.27 mJ、105.00 g和8.30 mJ快速下降至1.0%添加量時的153.33 g、2.93 mJ、58.67 g和5.30 mJ,分別降低了35.0%、44.4%、44.1%和36.1%,4個指標(biāo)的衰減速度較為一致。當(dāng)膠原蛋白肽添加量在2.0%～5.0%時,由膠原蛋白肽添加量增加引起的這4個指標(biāo)的下降趨勢略有差異。隨著膠原蛋白肽添加量的增加粘性以躍階形式快速衰減,由2.0%～3.0%添加量時的穩(wěn)定值跳躍降低至4.0%～5.0%添加量時的穩(wěn)定值,在5.0%添加量時衰減至1.57 mJ(降低了70.2%);隨著膠原蛋白肽添加量的增加其它3個指標(biāo)的衰減趨勢逐漸減弱,在5.0%添加量時分別衰減至127.33 g、48.00 g和4.30 mJ(降低了46.0%、54.3%、48.2%)。酸奶粘性與乳中酪蛋白尺寸密切相關(guān),尺寸越小粘性越低[23],膠原蛋白肽可能影響酸奶中酪蛋白膠束的形成,進(jìn)而降低了酸奶的粘性。

圖3 不同酸奶樣品的質(zhì)構(gòu)特性隨膠原蛋白肽添加量的變化Fig.3 Textural characteristic of yogurt sample varied with Cpa注:Ha:硬度;Ad:粘性;Sp:彈性;Gu:膠著性;Ch:咀嚼性;Co:內(nèi)聚性。

為定量表示膠原蛋白質(zhì)太添加量對酸奶硬度、粘性、膠著性、咀嚼性的影響規(guī)律,從而有效調(diào)控膠原蛋白肽添加量對酸奶質(zhì)構(gòu)特性的定量影響。本研究采用Log3p1模型擬合歸一化的硬度(Hag)、膠著性(Gug)和咀嚼性(Chg),采用BiDoseResp模型擬合歸一化的粘性(Adg)(圖4),指標(biāo)歸一化值表示添加不同量膠原蛋白肽酸奶樣品的指標(biāo)測量值與未添加膠原蛋白肽酸奶樣品指標(biāo)測量均值的比值,利用最小二乘法回歸分析得到的Hag、Adg、Gug和Chg經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ头謩e表示為:

圖4 歸一化的膠原蛋白肽酸奶硬度(Hag)、粘性(Adg)、膠著性(Gug)和咀嚼性(Chg)的回歸分析結(jié)果Fig.4 Regressed results of generalized hardness(Hag),adhesiveness(Adg), gumminess(Gug),chewiness(Chg)of Cpa yoghurt by least-square fitting

Hag=0.77-0.14×ln(Cpa-0.01)

式(5)

式(6)

Gug=0.65-0.11×ln(Cpa-0.01)

式(7)

Chg=0.72-0.07×ln(Cpa)

式(8)

2.5 不同添加量的膠原蛋白肽對酸奶微觀結(jié)構(gòu)的影響

膠原蛋白肽明顯改變了酸奶的微觀結(jié)構(gòu),且添加量越高對酸奶微觀結(jié)構(gòu)影響越大(圖5)。未添加膠原蛋白肽酸奶樣品的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)均勻、細(xì)致、有規(guī)則、蛋白質(zhì)分布更平滑和具有系統(tǒng)性,蛋白質(zhì)之間交聯(lián)程度高,孔隙度均勻,蛋白質(zhì)高交聯(lián)度降低了凝膠的滲透性[24],表現(xiàn)出較高的硬度(圖3)。與未添加膠原蛋白肽酸奶樣品微觀結(jié)構(gòu)相比,添加0.6%的膠原蛋白肽酸奶樣品的微觀結(jié)構(gòu)變化很小,形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)仍緊密、細(xì)致,蛋白質(zhì)之間交聯(lián)度高;添加1.0%膠原蛋白肽改變了酸奶凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),孔隙度均勻性降低且空隙變大,蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)程度降低,凝膠結(jié)構(gòu)變粗糙;添加2.0%或5.0%膠原蛋白肽時,酸奶凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更粗糙、疏松、不均勻、孔隙度更大、蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)效果變差。酸奶的微觀結(jié)構(gòu)與質(zhì)構(gòu)特性密切相關(guān)[25],膠原蛋白肽的加入破壞了酸奶蛋白質(zhì)之間的交聯(lián),而蛋白質(zhì)交聯(lián)程度與酸奶凝膠硬度呈正相關(guān)[24],即隨著膠原蛋白質(zhì)肽添加量增加酸奶凝膠硬度呈現(xiàn)降低趨勢(圖2)。靜電、極性、疏水作用是形成凝膠的主要作用力,靜電相互作用/極性相互作用的平衡促進(jìn)凝膠的形成[23],膠原蛋白肽的加入打破了原料乳中這種平衡,進(jìn)而改變了酸奶凝膠結(jié)構(gòu)。結(jié)合酸度變化和發(fā)酵的結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加膠原蛋白肽抑制了乳酸菌的發(fā)酵,進(jìn)而影響了酸奶凝膠的形成,從而使質(zhì)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)變差。

圖5 添加不同量膠原蛋白肽酸奶樣品的微觀結(jié)構(gòu)(1000×)Fig.5 Effect of Cpa on yogurt micromorphology(1000×)注:a:Cpa=0;b:Cpa=0.6%;c:Cpa=1.0%;d:Cpa=2.0%;e:Cpa=5.0%。

3 討論與結(jié)論

膠原蛋白肽的添加改變了酸奶的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變了持水能力,多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)改變源于膠原蛋白肽影響著酸奶的發(fā)酵。因?yàn)槎嚯牡氖杷院碗姾尚杂绊懼锏睦枚?當(dāng)多肽中含有較高的組氨酸、賴氨酸、谷氨酸和絲氨酸等親水氨基酸時可以提高乳酸菌的生長活性[9]。適量的添加膠原蛋白肽可以改變酸奶中氨基酸的組成,從而改善酸奶的發(fā)酵過程,但是當(dāng)大量的膠原蛋白肽添加至酸奶時,不利于酸奶的發(fā)酵。Shori等[17]試驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)膠原蛋白添加至酸奶中改變了酸奶發(fā)酵。這種發(fā)酵的影響一定程度上改變了酸奶的質(zhì)構(gòu)特性。

添加膠原蛋白肽影響酸奶的品質(zhì),酸奶品質(zhì)的變化可能歸因于膠原蛋白肽影響了酸奶的發(fā)酵,而發(fā)酵影響了酸奶網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。而且膠原蛋白肽對酸奶品質(zhì)的影響程度與其添加量有關(guān)。添加量≤0.6%時,隨添加量的改變酸奶品質(zhì)變化明顯;添加量>0.6%時,隨添加量的改變酸奶品質(zhì)變化不明顯。本研究提出了定量評估膠原蛋白添加量對各類指標(biāo)歸一化結(jié)果影響程度的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>