王萌萌,史 瑛,李智琪,毛 健,張秀紅

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041004;2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;3.山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,山西臨汾 041004)

中國白酒的工藝特點(diǎn)是制曲釀酒。大曲的制備采用生料制曲、自然接種、開放培養(yǎng)的生產(chǎn)方式,整個(gè)釀酒過程處于開放環(huán)境中,白酒釀造涉及到的微生物非常復(fù)雜,主要包括酵母菌、細(xì)菌、霉菌、放線菌等[1-2]。清香型白酒主要采用地缸發(fā)酵的方式生產(chǎn),厭氧環(huán)境下存活的微生物主要包括酵母菌和乳酸菌。乳酸菌通過發(fā)酵代謝產(chǎn)生乳酸,進(jìn)而與乙醇酯化產(chǎn)生白酒香氣成分乳酸乙酯,促進(jìn)酒體的形成,尤其在清香白酒中,主體香氣成分就是乙酸乙酯和乳酸乙酯,因此乳酸菌在清香白酒釀造中具有重要作用。但是在每年春末夏初,隨著氣溫的升高,釀酒環(huán)境中的乳酸菌開始大量繁殖,導(dǎo)致酒醅中乳酸菌大幅增加,使一部分高粱淀粉降解的還原糖轉(zhuǎn)化為乳酸,從而降低產(chǎn)酒量。同時(shí)乳酸過量會產(chǎn)生大量乳酸乙酯,而改變酒體香氣成分比例,降低基酒質(zhì)量[3-4]。目前各個(gè)酒企普遍缺乏夏季有效控制乳酸菌數(shù)量的手段和方法,因此在夏季來臨前選擇停產(chǎn)。事實(shí)上在停產(chǎn)前,基酒的產(chǎn)量和質(zhì)量也會受到一定的影響。

乳酸菌是白酒釀造中重要的功能微生物,而乳酸菌在釀酒環(huán)境中的數(shù)量是控制基酒品質(zhì)和質(zhì)量的重要條件。細(xì)菌素是乳酸菌產(chǎn)生的一類競爭性抑制親緣關(guān)系較近的天然蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)[5],且在食品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[6]。Mora等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠有效促進(jìn)近緣菌株自溶。因此可以用作控制乳酸菌數(shù)量的方法和策略。目前關(guān)于酒醅乳酸菌細(xì)菌素的研究尚未見報(bào)道。本研究從清香型白酒酒醅中篩選出產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌,分析其細(xì)菌素特性以及對釀酒微生物的影響,為夏季酒醅控酸開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清香型酒醅 山西省杏花村汾酒廠股份有限公司提供;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)J2-1、J7-2、J10-1、J12-1、Q4-5、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientails)Q3-1 分離自汾酒大曲及酒醅,保存于山西師范大學(xué)汾酒釀造過程研究中心;金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 由山西師范大學(xué)汾酒釀造過程研究中心提供;胰蛋白酶(≥2500 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥2000 U/mg) 阿拉丁試劑公司;蛋白酶K(≥40 U/mg)、胃蛋白酶(≥2500 U/mg) 上海生工;其余藥品 均為國產(chǎn)分析純。

Thermo 905/490 L-80 ℃超低溫冰箱 賽默飛世而科技(中國)有限公司;DYY-6C型電泳儀 六一儀器廠;Gel Doc XR+凝膠成像儀 Bio-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 清香酒醅中乳酸菌的分離 無菌條件下將清香酒醅稀釋至10-5、10-6、10-7后,分別取200 μL稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基中。將符合乳酸菌形態(tài)的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色和觸酶試驗(yàn)[8-9]。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩 將分離純化后的乳酸菌菌株在MRS液體培養(yǎng)24 h后,離心(12000 g、10 min)過濾,得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液[10-12]。以金黃色葡萄球菌(S.aureus)、大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)為指示菌,以楊尚嬌等[13]的方法篩選產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性

1.2.3.1 酸性物質(zhì)和過氧化氫試驗(yàn) 將液體培養(yǎng)基的pH分別用1.0 mol/L乳酸、乙酸進(jìn)行調(diào)節(jié),使其與菌株發(fā)酵上清液的pH相同[14-15]。同時(shí),調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液的pH至7.0,保持過氧化氫酶濃度在1.0 mg/mL,37 ℃溫浴2 h后,調(diào)回初始值[16-17]。S.aureus為指示菌,以楊尚嬌等[13]方法檢測抑菌物質(zhì)。

1.2.3.2 蛋白酶敏感性試驗(yàn) 使用木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶檢測蛋白酶敏感性,S.aureus為指示菌,參照1.2.3.1的方法檢蛋白酶敏感性[15-17]。

1.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定 用CTAB法[18]提取乳酸菌DNA作為模板,細(xì)菌通用引物1492R和27F PCR擴(kuò)增16S rDNA片段,送生工(上海)公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過MEGA 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析,構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.5 乳酸菌的生長及其細(xì)菌素的抑菌活性 將乳酸菌按3%接種量接種于液體培養(yǎng)基中,每隔2 h測OD600值。同時(shí),每4 h制備一次發(fā)酵上清液,S.aureus為指示菌,檢測抑菌直徑[19]。具體方法參照1.2.2。

1.2.6 乳酸菌細(xì)菌素理化性質(zhì)探究 將乳酸菌細(xì)菌素應(yīng)用的首要條件是,乳酸菌細(xì)菌素能夠在釀酒環(huán)境中保持活性,因此需要進(jìn)一步探究乳酸菌細(xì)菌素的穩(wěn)定性。

1.2.6.1 乳酸菌細(xì)菌素穩(wěn)定性探究 取4、30、60、90、121 ℃探究乳酸菌細(xì)菌素溫度耐受性;將發(fā)酵上清液的pH調(diào)整至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0,測定乳酸菌細(xì)菌素pH耐受性[20-22]。S.aureus為指示菌,參照楊尚嬌等[13]方法檢測。

1.2.6.2 乳酸菌細(xì)菌素對釀酒微生物的影響 選取酒醅中微生物酵母菌為指示菌,檢測乳酸菌細(xì)菌素對酒醅中主要釀酒微生物的影響,參照楊尚嬌等[13]方法檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)三次,采用Graphd 6.0、SPSS 24.0等對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及篩選

將清香酒醅來源的菌懸液涂布在MRS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并進(jìn)行劃線分離,菌株YP36在37 ℃下培養(yǎng)48 h后,生長狀況如圖1所示:YP36菌落呈圓形、表面凸起、濕潤、邊緣整齊,形態(tài)為桿狀,無鞭毛,符合乳酸菌形態(tài)特征。

圖1 菌株YP36菌落及菌體形態(tài)Fig.1 Colony and morphology of strain YP36注:A:乳酸菌菌落形態(tài);B:10×100顯微鏡形態(tài)示意圖。

直徑為0.8～2.0 mm、白色或微白色、具有光澤的圓形單菌落,且革蘭氏染色陽性,觸酶陰性的菌株初步認(rèn)為乳酸菌。共篩選出符合乳酸菌形態(tài)及生理特征的菌株146株。

對146株菌株進(jìn)行細(xì)菌素檢測,有10株菌能同時(shí)抑制S.aureus、E.coli、B.subtilis,結(jié)果見表1。其中YP36上清液對3種指示菌的抑菌直徑均大于15 mm,對S.aureus的抑菌直徑達(dá)19.50 mm,抑制能力最強(qiáng),其抑制作用見圖2。其余抑菌效果好的菌株有MC15-1、SL28和MC49-1,因此,選取這4株菌進(jìn)行后面的研究。

表1 乳酸菌細(xì)菌素對指示菌的抑制作用Table 1 Antibacterial effects of lactic acid bacteria bacteriocin on indicator bacterial

圖2 乳酸菌YP36細(xì)菌素對指示菌的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of lactic acid bacteria YP36 bacteriocin on indicator bacteria注:A:金黃色葡萄球菌;B:大腸桿菌;C:枯草芽孢桿菌。

2.2 乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素的特性

2.2.1 酸性物質(zhì)和過氧化氫試驗(yàn) Vázquez等[23]認(rèn)為乳酸菌在生長時(shí)抑制其他菌株的生長的主要原因在于:乳酸菌能夠產(chǎn)生酸、過氧化氫及細(xì)菌素等物質(zhì)。

在排除乳酸、乙酸和過氧化氫試驗(yàn)中,無菌MRS液體培養(yǎng)基經(jīng)乳酸、乙酸調(diào)至4株菌株發(fā)酵24 h后的pH后,以S.aureus為指示菌做抑菌試驗(yàn),結(jié)果抑菌圈都為零,表明沒有抑菌作用;YP36、MC15-1、SL28、MC49-1的發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶處理后進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果見表2。從表2可以看出,4株菌的發(fā)酵上清液經(jīng)過氧化氫酶處理后均能夠抑制乳酸菌的生長,抑菌直徑與未處理的菌株發(fā)酵液相比,略有下降但不顯著(P>0.05),表明過氧化氫不是主要的抑菌物質(zhì)。

表2 過氧化氫酶處理對乳酸菌菌株抑菌活性的影響Table 2 Effect of catalase treatment on antibacterial activity of LAB strains

2.2.2 蛋白酶敏感性試驗(yàn) 上述4株乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)不同類型的蛋白酶處理后,試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。與對照組相比,YP36發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶K、胃蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低(P<0.05),表明YP36發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)對蛋白酶K、胃蛋白酶敏感;MC15-1發(fā)酵上清液經(jīng)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低(P<0.05);SL28抑菌物質(zhì)對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感(P<0.05);MC49-1對胰蛋白酶敏感(P<0.05)。乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶處理后,抑菌直徑顯著降低。試驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵上清液中存在一種能夠被蛋白酶分解的抑菌物質(zhì),初步判斷抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)屬性。

圖3 蛋白酶處理對乳酸菌抑菌活性的影響Fig.3 Effect of protease treatment on antibacterial activity of LAB strains注:A:YP36;B:MC15-1;C:SL28;D:MC49-1；不同小寫字母代表差異顯著；圖5同。

2.3 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

對篩選到的4株抑菌活性高的乳酸菌提取其基因組DNA,PCR擴(kuò)增16S rDNA后測序,測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果如圖4所示,與YP36親緣關(guān)系最近的是植物乳桿菌(LactobacilluplantarumMT231813.1);與MC15-1、MC49-1親緣關(guān)系最近的是短乳桿菌(LactobacillusbrevisAB362619.1)和(LactobacillusbrevisFJ476121.1);與SL28親緣關(guān)系最近的是布氏乳桿菌(LactobacillusbuchneriAB300611.1)。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic relationships of four lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌生長曲線及其細(xì)菌素的抑菌活性

根據(jù)乳酸菌生長曲線及其細(xì)菌素的抑菌活性來掌握乳酸菌的生長情況與細(xì)菌素產(chǎn)量的關(guān)系,結(jié)果表明:乳酸菌在生長遲緩期時(shí),對指示菌無抑制作用,當(dāng)乳酸菌進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí),對指示菌的抑制作用逐漸趨于穩(wěn)定。結(jié)果如圖5所示:YP36在10 h進(jìn)入穩(wěn)定期,此時(shí)發(fā)酵上清液的抑菌直徑呈上升趨勢,在第20 h抑菌直徑達(dá)到最大;MC15-1在16 h進(jìn)入穩(wěn)定期,而發(fā)酵上清液的抑菌直徑在20 h達(dá)到最大;SL28菌株的生長量與抑菌物質(zhì)呈同步增長態(tài)勢,在菌株到達(dá)穩(wěn)定期16 h時(shí),抑菌直徑達(dá)到最大;MC49-1在12 h進(jìn)入穩(wěn)定期,在16 h時(shí)抑菌直徑最大。因此,綜合考慮,選取20 h觀察抑菌直徑。

圖5 乳酸菌生長曲線及其細(xì)菌素的抑菌活性Fig.5 The growth curve of lactic acid bacteria and the bacteriostasis activity of their barteriocin

2.5 乳酸菌細(xì)菌素穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.5.1 乳酸菌細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性試驗(yàn) 為了考察酒醅乳酸菌細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性,將4株菌的細(xì)菌素分別在不同溫度下處理30 min后進(jìn)行抑菌活性測定,結(jié)果如圖6所示,隨著熱處理溫度的升高,YP36及SL28抑菌活性無顯著變化(P>0.05)。MC15-1和MC49-1在4～60 ℃條件下抑菌直徑無顯著變化(P>0.05),在60～121 ℃時(shí),抑菌直徑隨著溫度的升高有所降低,當(dāng)溫度在121 ℃時(shí),仍有抑菌活性,分別是4 ℃下的抑菌活性的68.4%和56.38%。試驗(yàn)表明,四株菌的抑菌物質(zhì)均具有一定的耐熱性。

圖6 溫度對乳酸菌細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the bacteriestasis activity of LAB barteriocin

2.5.2 乳酸菌細(xì)菌素pH穩(wěn)定性 為了考察酒醅乳酸菌細(xì)菌素的pH穩(wěn)定性,將4株菌的發(fā)酵上清液調(diào)整到不同的pH后進(jìn)行抑菌活性測定,結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出:4株菌的酸堿穩(wěn)定性變化趨勢非常相似,pH在2.0～4.0范圍內(nèi),抑菌活性均無顯著變化(P>0.05);pH在4.0～6.0時(shí),抑菌活性略有下降;在pH達(dá)8.0時(shí)4株菌的抑菌活性均消失。試驗(yàn)結(jié)果表明:4種乳酸菌細(xì)菌素在酸性環(huán)境下活性較高。

圖7 pH對乳酸菌細(xì)菌素抑菌活性的影響Fig.7 Effect of pH on the bacteviestasis activity of LAB barteriocin

2.5.3 乳酸菌細(xì)菌素對釀酒微生物的影響 為了考察乳酸菌細(xì)菌素對釀酒功能菌的影響,選取清香型釀酒環(huán)境中主要微生物S.cerevisiae、I.orientails作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果如表3所示:酒醅乳酸菌細(xì)菌素對所有實(shí)驗(yàn)的酵母菌無抑制作用。

表3 乳酸菌細(xì)菌素對釀酒微生物的影響Table 3 Effects of lactic acid bacteria bacteriocin on brewing microorganisms

3 結(jié)論

本研究利用牛津杯法從清香酒醅中分離得到10株對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌活性的乳酸菌。用16S rDNA序列分析對金黃色葡萄球菌抑制最強(qiáng)的4株乳酸菌YP36、MC15-1、SL28、MC49-1。進(jìn)一步對這4株菌的抑菌物質(zhì)進(jìn)行研究,排除乳酸、乙酸和過氧化氫后仍有抑菌活性,個(gè)別蛋白酶處理后抑菌活性會下降,表明抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。在pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中,4株菌抑菌物質(zhì)都在酸性條件下抑菌活性較強(qiáng)，都具有一定的熱穩(wěn)定性。4株菌的細(xì)菌素對篩選酒醅來源酵母菌無抑制作用。