伍怡斐,鐘錦耀,鄭經(jīng)紹,丁少云,梁麗月,黃 葦,*
(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)電子工程學(xué)院,廣東廣州 510642;3.新興縣微豐農(nóng)業(yè)科技有限公司,廣東新興 527400)
紫米,俗稱“紫珍珠”,是有色稻中的一類[1],因其種皮、果皮以及糊粉層中富集花色苷,使其糙米呈現(xiàn)紫色[2]。紫糙米花色苷含量豐富,營養(yǎng)價值高,色彩美觀,香氣獨特,具有深加工價值?;ㄉ詹粌H是一種色彩艷麗自然的天然食用色素[3],同時還具有抗氧化、抑菌、抗癌[4]、保護視力[5]、降血糖[6]等保健功能,是替代人工合成食用色素的理想資源[7]。但花色苷在水或乙醇溶液中極不穩(wěn)定,其降解受到自身結(jié)構(gòu)、光、氧、溫度、pH、金屬離子、酶、氧化劑等的影響[8-10],高度不穩(wěn)定性為富含花色苷的物料加工及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用帶來阻礙。研究環(huán)境和加工中各因素的影響,對提高紫米花色苷在食品貯藏加工中的保存率顯得非常必要[7,11]。
食品中花色苷的降解與光照強度、光照持續(xù)時間等因素有關(guān)。唐榕等[12]研究光照對桑葚花色苷的影響時發(fā)現(xiàn)室外光下花色苷的穩(wěn)定性明顯變差,與室內(nèi)光和避光相比,室外光下保存率急劇下降,總色差變化急劇上升。蔣新龍[14]證明黑米花色苷在pH1.0、3.0、4.5這3種酸度下,強光、自然光、避光條件對花色苷降解的影響有顯著差異,室外強光會加速花色苷的降解。曾惠琴等[15]發(fā)現(xiàn)紫外線和陽光照射均會加速黑米色素的降解。目前的研究主要是區(qū)分自然光、紫外光對花色苷的影響。但光種類對其穩(wěn)定性的影響鮮見報道。而太陽光根據(jù)不同的波長范圍,可分為以下8種光:紫外光(190~380 nm)、紫光(380~450 nm)、藍(lán)光(450~490 nm)、綠光(490~565 nm)、黃光(565~590 nm)、橙光(590~625 nm)、紅光(625~740 nm)、紅外光(740~1000 nm)。這些光具有不同性質(zhì),如果能了解其危害程度,在包裝實際應(yīng)用中就可以根據(jù)材料的透光性質(zhì)進行選擇,為避光包裝提供更精確科學(xué)的判斷,在保留包裝物可透視性的同時盡可能保護內(nèi)裝物的穩(wěn)定,獲得良好的包裝效果[16]。同時,也有研究報道表明,降低貯藏環(huán)境中的氧含量[17-18]和添加輔色劑[19]有利于提高食品中花色苷保存率,但綜合幾種因素應(yīng)用于提高花色苷穩(wěn)定性的研究較少。
本研究主要從光與氧這兩個環(huán)境因素出發(fā),探究了光輻照度、光的波長范圍、溶氧量對花色苷溶液穩(wěn)定性的影響。同時探究金屬離子、輔色素兩種添加物對花色苷溶液穩(wěn)定性的影響,最后通過正交試驗優(yōu)選出維持紫米花色苷穩(wěn)定的方案,為紫米產(chǎn)品的加工及貨架期穩(wěn)定提供理論依據(jù)。
紫米米糠(紫稻經(jīng)礱谷去殼后經(jīng)過碾白所得的紫米皮層部分,紫米花色苷主要集中于該部分) 新興縣微豐農(nóng)業(yè)科技有限公司提供;無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鋁、硫酸銅、硫酸鋅、過氧化氫等 均為國產(chǎn)分析純;香草醛、丁香醛、綠原酸、沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸等試劑(純度大于95%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;TL-50型脫氧劑 東莞市欣榮天麗科技實業(yè)有限公司。
ZWB1選擇吸收型濾光片、JB400、JB450、JB490、HB610、HB700截止型濾光片 南通銀興光學(xué)有限公司;TU-1810型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;Phs-3C數(shù)字pH計、JPB-607A便攜式溶解氧測定儀 上海雷磁儀電科學(xué)儀器有限公司;SPX-150型生化培養(yǎng)箱 上海申賢恒溫設(shè)備廠;AHD 500W球型氙燈 深圳市宏達(dá)光電科技有限公司;TXN-15020型外置調(diào)光器 深圳市兆信電子儀器設(shè)備有限公司;91150V太陽能光強測試儀 美國Newport公司。
1.2.1 紫米花色苷溶液的制備 稱取5 g過60目篩的紫米米糠于錐形瓶中,加入pH4的15%乙醇200 mL,塞上硅膠塞,60 ℃水浴加熱提取120 min(按此條件獲得的花色苷溶液濃度為0.075±0.015 mg/mL),抽濾,濾液繼續(xù)用0.2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH到4(常見的酒精飲料的pH為3.5~5.0),得到紫米花色苷溶液,裝棕色瓶備用。
1.2.2 貯藏環(huán)境中光與氧氣對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響
1.2.2.1 光輻照度對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 利用氙燈(模擬太陽光源)花色苷穩(wěn)定性測試儀(圖1)對花色苷穩(wěn)定性進行測試。把花色苷溶液(1.2.1提取所得,下同)放置圖1樣品臺,于不同光輻照度(0、10、30、50、70 mW/cm2)下照射30 h(預(yù)實驗顯示樣品經(jīng)過30 h的照射,處理間差異顯著),腔體溫度控制為25 ℃,取樣測定花色苷含量,計算光輻照度對紫米花色苷的影響。
圖1 氙燈(模擬太陽光源)花色苷穩(wěn)定性測試儀示意圖Fig.1 Schematic diagram of xenon lamp anthocyanin stability tester注:1:調(diào)光器;2:球型氙燈;3:散熱風(fēng)扇;4:溫度探測儀;5:樣品臺;6:控溫系統(tǒng)。
1.2.2.2 入射光波長范圍對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 量取20 mL花色苷溶液于無色透明玻璃瓶中,加塞封口,平放于樣品臺,置于光輻照度為25 mW/cm2的氙燈下。以不同型號的濾光片控制入射光的波長范圍為:ZWB1(280~370 nm)、JB400(400~1000 nm)、JB450(450~1000 nm)、JB490(490~1000 nm)、JB610(610~1000 nm)、JB700(700~1000 nm)。以上述不同波長范圍的光照射75 h,腔體溫度為25 ℃,每15 h取樣測定花色苷含量。計算不同入射光波長范圍對花色苷穩(wěn)定性的影響。
1.2.2.3 溶氧量對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 向內(nèi)徑為240 mm的透明干燥器底部放入25包TL-50型脫氧劑,將花色苷溶液置于干燥器的瓷板上,蓋上干燥器蓋子密封保存3 d,獲得低溶氧量的花色苷溶液處理組(溶氧量為0.2 mg/L);以正常溶氧量組(同樣的透明干燥器,但不放入脫氧劑,花色苷溶液溶氧量為7.2 mg/L)為對照。于室內(nèi)自然光照和完全避光條件下放置60 d,每10 d取樣測定花色苷含量,計算溶氧量對花色苷穩(wěn)定性的影響。
1.2.3 輔助添加物對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響
1.2.3.1 金屬離子對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 分別配制含10 mmol/L 不同金屬離子(Al3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+)的花色苷溶液,放置室內(nèi)(室內(nèi)自然光照,室溫25 ℃,下同)觀察溶液的顏色變化與沉淀產(chǎn)生情況。
選擇其中對花色苷有保護作用的金屬離子(Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+),分別配制含不同濃度梯度金屬離子的花色苷溶液,放置室內(nèi)60 d,每10 d取樣測定花色苷含量,計算金屬離子及濃度對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響。
1.2.3.2 輔色素對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 向花色苷溶液中加入摩爾比(花色苷∶輔色素)為1∶10的6種(香草醛、丁香醛、綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸)輔色素。室內(nèi)自然光照,室溫25 ℃放置,測定第60天花色苷的含量,計算輔色素對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響。挑選出對紫米花色苷保護作用最佳的輔色素,加入不同摩爾比(1∶0.0、1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶20)的輔色素,放置室內(nèi)60 d,每10 d取樣測定花色苷含量,計算不同摩爾比的輔色素對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響。
1.2.4 紫米花色苷的穩(wěn)定性條件優(yōu)選 在上述花色苷穩(wěn)定性單因素試驗基礎(chǔ)上,選取入射光波長范圍、Zn2+濃度、沒食子酸的摩爾比及溶氧量為變量,把樣品置于光輻照度為25 mW/cm2的氙燈下照射45 h,控制腔體溫度為25 ℃,進行L9(34)的正交試驗,優(yōu)選保持紫米花色苷穩(wěn)定性的條件。具體因素及水平見表1。
表1 紫米花色苷穩(wěn)定性試驗正交因素與水平設(shè)計Table 1 Orthogonal factors and level design for stability test of anthocyanins
1.2.5 測定與計算方法
1.2.5.1 花色苷含量測定方法 參考趙月等和修茹燕[20-21]的方法并加以改進,花色苷溶液離心(8000 r/min,15 min,25 ℃),取0.5 mL的上清液用pH1.0 HCl-KCl緩沖液定容至10 mL,靜置15 min,在535 nm下測定吸光值A(chǔ)。
1.2.5.2 花色苷保存率與降解率計算方法 花色苷的保存率:
式中:At-處理時間為t時的吸光值;A0-初始的吸光值。
花色苷降解率:p(%)=1-s
1.2.5.3 不同波長范圍的光對花色苷穩(wěn)定性影響的計算方法 不同種類可見光的花色苷降解率:
Pa~b(%)=pa~1000-pb-1000
不同種類可見光的單位波段花色苷降解率:
紫外濾光片的透過率修正系數(shù):
紫外光的單位波段花色苷降解率:
式中:p-波長范圍內(nèi)的花色苷總降解率%;a、b-透過相應(yīng)濾光片的入射光起始值;單位波段-指每10 nm的光;P-單位波段光的花色苷降解率%;T為濾光片的光透過率%。
采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用Origin 8.6作圖,所有實驗進行3次重復(fù),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
2.1.1 光輻照度對花色苷穩(wěn)定性的影響 不同季節(jié)及一天中不同時段的光輻照度差別極大。以廣州為例,7月份的太陽總輻射為460 MJ/m2,而2月份的太陽總輻射只有220 MJ/m2[22]。本研究于2019年10月20日對廣州室外光輻照度進行測量,發(fā)現(xiàn)正午12點的光輻照度為50 mW/cm2,而傍晚6點只有1 mW/cm2,相差50倍,顯示利用自然光連續(xù)開展光對花色苷穩(wěn)定性影響實驗具有一定的局限性。因此利用圖1的裝置,在模擬太陽光光譜條件下,研究光輻照度對花色苷穩(wěn)定性的影響。經(jīng)過30 h不同光輻照度處理,結(jié)果如圖2所示,花色苷的保存率隨著光輻照度的增強急速下降,二者呈負(fù)量效關(guān)系,決定系數(shù)為0.9859。光輻照度70 mW/cm2時,經(jīng)過30 h的照射,花色苷的保存率只有49.60%。究其原因,光照會使基態(tài)的花色苷吸收光能后轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的花色苷,激發(fā)態(tài)的花色苷在C4位易發(fā)生水解后轉(zhuǎn)變?yōu)镃4加成化合物,隨后該加成物的C2位發(fā)生水解開環(huán)形成中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物繼續(xù)降解生成酚酸和醛類[12]。光輻照度越大,其光能越強,對花色苷的穩(wěn)定性破壞越大,因此,紫米花色苷溶液貯藏不宜暴露在強光中。已有報道也表明,在多種含花色苷的體系里,花色苷在黑暗的環(huán)境中的半衰期會比在光照中的要長[23-25]。但另一方面,在進行花色苷的破壞性加速實驗時,利用強光處理來縮短實驗時間,是一種高效簡便的方法。
圖2 光輻照度對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of light irradiance on the stability of anthocyanins
2.1.2 入射光波長范圍對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 經(jīng)測試所得,圖3為供試的各型號濾光片的透過率光譜,ZWB1在280~370 nm之間的平均透過率達(dá)81%,其余型號的濾光片在其透光范圍的平均透過率達(dá)90%。從圖4可看出,樣品以完全避光環(huán)境為對照,經(jīng)過不同波長范圍的光照射后,花色苷的保存率均下降,紫外光和不同波長范圍可見光都對花色苷有不同程度的破壞作用。處理75 h后,完全避光處理對照組的花色苷保存率最高,為82.46%,紫外光處理組(280~370 nm)的保存率為79.07%。經(jīng)由波長范圍為400~1000 nm光照射處理75 h后,花色苷的保存率最低僅有39.86%,經(jīng)由450~1000、490~1000、610~1000、700~1000 nm波長范圍的光處理后保存率分別為43.70%、56.37%、69.46%、74.01%。由此可以得知,入射光的波長范圍越大,花色苷破壞越嚴(yán)重,范圍越小,花色苷保存率越高。
圖3 濾光片的透過率光譜Fig.3 Filtering rate spectrum of filter
圖4 不同波長范圍的光對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of light of different wavelength range on the stability of anthocyanins
2.1.3 溶氧量對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 花色苷的高度不飽和結(jié)構(gòu)對氧氣頗為敏感,在分子氧存在的條件下,花色苷會降解生成無色的或褐色的物質(zhì)。由圖5可以看出,在貯藏期內(nèi),正常溶氧量條件下,室內(nèi)自然光照射處理組花色苷含量下降最快,60 d后,花色苷保存率只有36.58%,其次為正常溶氧量條件下,完全避光處理組,花色苷保存率為47.01%,而在低溶氧量條件下,室內(nèi)自然光照射和完全避光處理組的花色苷含量下降速度均較慢,下降曲線幾乎貼合,60天后,前者花色苷保存率為73.24%,后者為74.75%,二者差異并不顯著。
圖5 溶氧量與室內(nèi)光對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of dissolved oxygen and indoor light on the stability of anthocyanins
室內(nèi)的自然光照,經(jīng)測定光強約為(0.15±0.05) mW/cm2,在較弱的光照條件下,溶氧量才是影響花色苷穩(wěn)定性的主要因素,低溶氧量可以顯著(P<0.05)提高花色苷的保存率。而室內(nèi)自然光的影響只在較高溶氧量下才發(fā)揮顯著作用,光對花色苷的破壞主要表現(xiàn)為激發(fā)氧對花色苷的破壞。已有的報道也表明,真空處理有利于藍(lán)莓皮渣花色苷的保存[17],通氮氣除氧可以提高桔柚果皮花色苷穩(wěn)定性[18]。食品的加工、貯運及銷售通常在室內(nèi)自然光照條件下進行,由此可以推斷,控制溶液中的溶氧量對花色苷的保護起關(guān)鍵的作用。在富含花色苷的產(chǎn)品生產(chǎn)、貯藏過程中,通過真空處理、通氮、使用脫氧劑等方法來去除產(chǎn)品中的氧,能夠顯著提高花色苷的保存率。
2.2.1 金屬離子對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 金屬離子對花色苷穩(wěn)定性表現(xiàn)出多樣性。由表2可以看出,Al3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+對維持紫米花色苷的穩(wěn)定不利,會改變其溶液的顏色或產(chǎn)生大量沉淀物、絮狀物,因此在富含花色苷產(chǎn)品的加工或貯藏過程中,應(yīng)避免與Al3+、Cu2+、Fe2+、Fe3+接觸。但Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+離子則有維持花色苷穩(wěn)定的作用。進一步研究Zn2+、Mg2+、K+、Na+、Ca2+濃度對花色苷保存率影響,如表3所示,添加該5種金屬離子的花色苷保存率均比空白組要高,隨著其濃度的不同展現(xiàn)不同的變化趨勢。其中Zn2+對提高紫米花色苷的保存率最為有效,添加了5 mmol/L的Zn2+的花色苷比空白組保存率高14.27%。究其原因,可能是紫米花色苷的B環(huán)上含有鄰位羥基與Zn2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[26],提高了花色苷的穩(wěn)定性。
表2 不同金屬離子對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Table 2 Effects of different metal ions on the stability of anthocyanins
表3 金屬離子濃度對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of metal ion concentration on the stability of anthocyanins
2.2.2 輔色素對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響 輔色素是一類能與花色苷發(fā)生輔助成色作用的無色或顏色很淺(主要是淺黃色)的物質(zhì),能夠在酸性溶液中增加和修飾花色苷顏色的表現(xiàn),目前研究比較多的輔色素是類黃酮和酚酸[27-28]。由圖6可以看出,添加香草醛、丁香醛、綠原酸、沒食子酸、咖啡酸、阿魏酸6種物質(zhì)為輔色素,在濃度相同,即摩爾比同樣為1∶10的條件下,其花色苷保存率分別為53.61%、50.56%、59.01%、59.40%、50.03%、49.52%??瞻讓φ战M花色苷保存率為51.54%,丁香醛、咖啡酸、阿魏酸對紫米花色苷未表現(xiàn)出明顯保護作用。而香草醛、綠原酸和沒食子酸的花色苷保存率與空白對照差異顯著(P<0.05),尤其是后二者保護效果更佳。因綠原酸價格昂貴,且其水溶液有刺激性氣味,而沒食子酸價格便宜、安全、無不良?xì)馕?在濃度高于850 mg/100 mL時才會產(chǎn)生柔和的酸感[29],低濃度的沒食子酸不會對食品原有的風(fēng)味產(chǎn)生影響。因此,添加沒食子酸作為輔色素更適用于保護食品中的花色苷。
圖6 輔色素種類對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of co-pigments on the stability of anthocyanins注:不同小寫字母代表顯著差異,P<0.05;圖7~圖8同。
探究沒食子酸濃度對紫米花色苷穩(wěn)定性影響,結(jié)果如圖7,可以看出,花色苷保存率存在差異,摩爾比在1∶2.5~1∶10.0之間,效果較好,具有很好的輔色作用,這與Roidoung等[30]研究沒食子酸對紅莓汁花色苷有保護作用的結(jié)論相一致,沒食子酸通過提供酚羥基中的H原子來清除自由基,使自由基的活性降低,從而限制了自由基與花色苷的相互作用。
圖7 沒食子酸的濃度對紫米花色苷穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of gallic acid concentration on the stability of anthocyanins
選取上述影響紫米花色苷穩(wěn)定性的四種因素:入射光波長范圍、Zn2+濃度、沒食子酸摩爾比、溶氧量,進行L9(34)正交試驗,正交試驗結(jié)果與方差分析結(jié)果見表4及表5。由表4可知,四種因素的影響大小依次為A>D>B>C,即入射光波長范圍>溶氧量>Zn2+濃度>沒食子酸摩爾比。由表5可知入射光波長范圍、Zn2+濃度、溶氧量對花色苷的穩(wěn)定性的影響均極顯著(P<0.01),在正交試驗選取的水平范圍內(nèi)沒食子酸的摩爾比影響不顯著(可任選添加水平)。
表4 紫米花色苷保護工藝的正交實驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results of anthocyanins protection process
表5 紫米花色苷保護工藝的正交試驗方差分析結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental anova results of anthocyanins protection process
由K值可得最優(yōu)組合為A3B1C3D1,即入射光波長范圍700~1000 nm,添加1 mmol/L的Zn2+,摩爾比為1∶15的沒食子酸,控制溶氧量為0.2 mg/L。因該優(yōu)選組合不在表4的處理組中,進行三次平行驗證實驗,顯示在此工藝條件下,紫米花色苷的保存率可達(dá)到91.12%±0.25%,與正交試驗的較優(yōu)組相比差異顯著(P<0.05),而對照組只有70.95%±0.01%。優(yōu)選組比對照組提高了28.43%。
因不同種類的光所覆蓋的波長范圍不同,通過對2.1.2中不同波長范圍光對花色苷穩(wěn)定性的影響結(jié)果進行進一步的計算,分析不同種類光單位波段(每10 nm)對花色苷的影響,計算方法見1.2.2.3。不同種類光280~370 nm(紫外光)、400~450 nm(紫光)、450~490 nm(藍(lán)光)、490~610 nm(主要表現(xiàn)為綠光)、610~700 nm(主要表現(xiàn)為紅光)單位波段對花色苷保存率的影響,如圖8所示,單色光中藍(lán)光的每單位波段對紫米花色苷造成3.17%降解率,紫外光、綠光、紫光、紅光依次為1.14%、1.09%、0.94%、0.51%,單位波段的藍(lán)光對花色苷的降解作用最強,處理間差異顯著(P<0.05),紅光最弱。在不采用完全避光包裝,考慮選用可透視的透明包裝時,盡量選取不透過藍(lán)光(450~490 nm)的包裝材料,而以選用透過紅光的材料為宜。
圖8 不同種類的光單位波段對紫米花色苷降解率的影響Fig.8 Effect of different light unit bands on the degradation rate of anthocyanins
通過分析儲藏環(huán)境與輔助添加物對紫米花色苷的穩(wěn)定性影響可得,光輻照度與花色苷保存率呈負(fù)量效關(guān)系。利用強光照射進行破壞性加速實驗是研究花色苷穩(wěn)定性的高效簡便方法。太陽光中的紫外光和可見光都對紫米花色苷有破壞作用,可見光波長范圍越大,其破壞性越大,單色光中藍(lán)光對花色苷的破壞最強,單位波段(每10 nm)破壞率達(dá)3.17%,是紅光的6倍,其他光的3倍,差異顯著(P<0.05)。使用只透過610~700 nm的紅色半透明材料包裝富含紫米花色苷的產(chǎn)品,不僅可以保持商品外觀的可透視性,還可兼顧花色苷在強光下的高保存率。在室內(nèi)光照射條件下,氧氣是影響花色苷穩(wěn)定性的主要因素。正常溶氧量的花色苷60 d后保存率為36.58%,脫氧處理后花色苷保存率為73.24%,保存率是前者的2倍,所以降低產(chǎn)品中的氧氣含量,是保護花色苷穩(wěn)定的關(guān)鍵。輔助添加物中,Zn2+和沒食子酸的護色效果較佳。本研究優(yōu)選出維持紫米花色苷穩(wěn)定性的工藝參數(shù):入射光波長范圍控制在700~1000 nm,控制溶氧量降低到0.2 mg/L,添加1 mmol/L的Zn2+及摩爾比為1∶15的沒食子酸,為紫米花色苷的包裝與貯藏提供一種方法。本研究使用脫氧的方法進行貯藏,可能導(dǎo)致厭氧菌的生長,所以如何避免厭氧菌的滋生仍需要進一步研究完善。