王 洋,王競儒,白東清,淡清華,于 波,余政豪,羅云龍

(天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室,天津 300384)

食源性病原菌是危害食品安全的重要因素之一。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila,A.hydrophila)是一類革蘭氏陰性食源性病原微生物[1],廣泛分布于各類環(huán)境,尤其是水體環(huán)境[2-3]。該菌具有耐藥性[4],因形成生物被膜而難以去除[5]。嗜水氣單胞菌易污染多種食物,以水產(chǎn)品為主,也能污染畜產(chǎn)品、禽肉以及果蔬[6]。嗜水氣單胞菌能夠引起冷血動物[7]和溫血動物[8]包括人類[9]的疾病,曾引發(fā)多起食品安全事件[10-11]。因此控制食品及其原料中的嗜水氣單胞菌對于保障食品安全非常必要[3,12]。

乳酸菌對各類食源性病原微生物具有較強的拮抗作用,可用于控制各類食品中的有害微生物[13-14]。乳酸菌的抑菌機理之一是分泌抗菌代謝產(chǎn)物,包括有機酸[15]、細菌素[16]和過氧化氫[17]等。其中L(+)-乳酸是乳酸菌代謝糖類所產(chǎn)生的基本代謝物,對人體無害[18],在一定濃度下對各類革蘭氏陰性菌和陽性菌具有廣譜抑殺作用[19]。但是革蘭氏陰性病原菌,包括嗜水氣單胞菌在適應了低濃度乳酸的脅迫后,可產(chǎn)生酸耐受性[20]。乳酸菌細菌素是部分乳酸菌產(chǎn)生的一類對革蘭氏陽性菌有顯著抑殺作用的肽類(少數(shù)乳酸菌細菌素可抑制革蘭氏陰性菌)[21]。有研究發(fā)現(xiàn),當細菌素與其他物質如乳酸[22]、精油[23]、EDTA[24-25]、六甲基磷酸鈉(sodium hexamethaphosphate)[26]、納米金粒子[27]、其他抗菌肽[28]共同使用時,對抗性的革蘭氏陰性菌也有較好的控制作用。有學者認為低濃度乳酸可造成革蘭氏陰性菌非致死傷,使其對細菌素敏感[29]。本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)細菌素特性可提高乳酸菌對革蘭氏陰性菌的抑制力[30]。然而目前尚不清楚乳酸與細菌素協(xié)同抑菌的作用及機理。

為探討細菌素與L-乳酸對于革蘭氏陰性菌是否具有協(xié)同抑制作用,本研究選用目前唯一成熟商業(yè)化且最具代表性的I類細菌素-乳酸鏈球菌素(Nisin)[31-32],研究其與低濃度L-乳酸對重要的革蘭氏陰性水產(chǎn)病原菌——嗜水氣單胞菌(標準菌株CICC 10500,ATCC 35654)的抑殺作用,為二者或其產(chǎn)生菌在食品中對抗嗜水氣單胞菌的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜水氣單胞菌CICC 10500(ATCC49140等同菌株)、嗜水氣單胞菌ATCC 35654 中科質檢有限公司;L-乳酸 純度>90%,西隴化工股份有限公司;食品級Nisin 天津艾瑪斯特生物科技有限公司;尼日利亞菌素、LB培養(yǎng)基 北京陸橋技術股份有限公司。

4MK2全波長多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific;Bioscreen全自動生長曲線分析儀 芬蘭百奧斯科林;BD Calibur流式細胞分析儀 美國Bioscience;UV-6100S分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 比濁法檢測抑菌活性 將活化好的嗜水氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基,使得活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、L-乳酸或Nisin溶液,配制成對照組、3.5 mmol/L L-乳酸處理組、Nisin(0.05 g/L)處理組、3.5 mmol/L L-乳酸+nisin(0.05 g/L)處理組(復合組)。每組樣品取100 μL,加入96孔板中,于30 ℃培養(yǎng)12 h,以酶標儀測定OD600值。

1.2.2 生長曲線法測定抑菌能力 將培養(yǎng)12～18 h的菌液接種于LB培養(yǎng)基,使得活菌數(shù)為1×107CFU/mL。在菌液中分別加入蒸餾水、L-乳酸或Nisin溶液,制成對照組、3.5 mmol/L L-乳酸處理組、Nisin(0.05 g/L)處理組、3.5 mmol/L L-乳酸+Nisin(0.01 g/L)及3.5 mmol/L L-乳酸+Nisin(0.05 g/L)處理組。每組樣品取200 μL,加入生長曲線儀專用培養(yǎng)板中,采用全自動生長曲線分析儀,于30 ℃連續(xù)培養(yǎng)至48 h,期間每間隔30 min測定OD600值,繪制生長曲線,以Gomptz模型擬合,計算生長參數(shù)。

1.2.3 致死作用 分別收集兩株活化好的對數(shù)期指示菌,以無菌生理鹽水離心洗滌2次(2000×g,4 min,4 ℃),以生理鹽水重懸,使活菌數(shù)為1×108CFU/mL,然后于30 ℃分別加入生理鹽水、3.5 mmol/L L-乳酸、Nisin(0.05 g/L)、3.5 mmol/L L-乳酸+Nisin(0.05 g/L)(復合組),處理后于8 h取樣,以梯度稀釋平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。

1.2.4 被膜形成情況 生物被膜爬片的制作及觀察:分別收集培養(yǎng)至對數(shù)末期(約24 h)的兩株嗜水氣單胞菌,以無菌生理鹽水洗3次,去除可能影響生物被膜形成的物質及信號分子。菌體以無菌LB培養(yǎng)基重懸,使得活菌數(shù)達到109CFU/mL。在加入預先放置無菌細胞爬片的24孔的聚苯乙稀孔板中,分別設置:對照組、3.5 mmol/L L-乳酸處理組、Nisin處理組、L-乳酸與Nisin協(xié)同處理組。30 ℃培養(yǎng)12 h后,參考Djordjevic等[33]方法,以結晶紫染色,以普通光學顯微鏡觀察生物被膜結構。

1.2.5 脂多糖的釋放 以嗜水氣單胞菌ATCC 35654為代表,將嗜水氣單胞菌菌懸液(108CFU/mL)在無菌生理鹽水中以0、1、2、3、4 mmol/L L-乳酸在4 ℃處理8 h后,離心(2000×g,4 min,4 ℃)收集上清液,測定上清液在201 nm(脂多糖特征吸收峰)的吸光值,以確定脂多糖(LPS)的釋放程度。

1.2.6 膜電動勢的測定 使用嗜水氣單胞菌CICC 10500成熟期菌體,分別以生理鹽水和含3.5 mmol/L L-乳酸的生理鹽水在4 ℃靜置處理3 h,離心(2000×g,4 min,4 ℃)收集菌體,重懸于含10 mmol/L葡萄糖溶液的生理鹽水中,加入10 μL的尼日利亞菌素在室溫下放置30 min以消除菌體pH動勢,隨后加入熒光探針DisC3(5)(終濃度5 μmol/L)于37 ℃放置10 min待用。在96孔板預先分別加入10 μL生理鹽水,以及不同濃度的Nisin溶液,加入90 μL處理好的嗜水氣單胞菌,立即掃描675 nm熒光值(激發(fā)波長660 nm),每30 s掃描一次,連續(xù)掃描15 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均用Excel 2003、Origin 8、SPSS 13.0進行分析處理。利用Excel軟件計算得出各組數(shù)據(jù)的標準偏差;利用Origin 8軟件繪制散點圖、柱狀圖及折線圖;利用SPSS軟件進行方差分析。每個實驗重復3次,每次重復包含至少3個平行數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 L-乳酸與Nisin對嗜水氣單胞菌生長的影響

探討乳酸與細菌素Nisin同時存在時對水產(chǎn)革蘭氏陰性病原菌的生長影響?？疾烊樗峋x產(chǎn)物L-乳酸與Nisin對指示菌的生長抑制作用,結果如圖1所示。與對照組相比,單獨的低濃度L-乳酸對嗜水氣單胞菌CICC 10500和ATCC 35654的生長均無顯著影響。與L-乳酸處理組相比,Nisin處理組、復合組OD600值均顯著下降(P<0.05)。說明在低濃度L-乳酸存在時,Nisin可以顯著降低指示菌的生長,L-乳酸與Nisin聯(lián)合作用對兩株嗜水氣單胞菌的生長抑制作用最顯著。

圖1 Nisin與低濃度L-乳酸對嗜水氣單胞菌的生長抑制作用Fig.1 Synergistic inhibition of low concentration L-lactic acid and nisin on growth of A. hydrophila注:不同小寫字母代表相同菌株差異顯著(P<0.05);圖3、圖5同。

2.2 L-乳酸與Nisin影響嗜水氣單胞菌生長曲線參數(shù)

圖2展示了Nisin與L-乳酸對嗜水氣單胞菌生長曲線和生長參數(shù)的影響。在培養(yǎng)的48 h內(nèi),對照組菌體快速增長,OD值迅速增高,很快進入對數(shù)期,并在培養(yǎng)的12 h內(nèi)進入平臺期。Nisin添加組與對照組生長趨勢相似,并無顯著差異。低濃度L-乳酸單獨存在時干擾了菌體的生長,而在L-乳酸基礎上進一步添加Nisin對2株指示菌的生長均表現(xiàn)出顯著的抑制效果,且抑制程度隨Nisin濃度的增加而提高。

圖2 Nisin與L-乳酸對嗜水氣單胞菌生長曲線的影響Fig.2 Interference of growth curve of A. hydrophila pathogen by nisin and L-lactic acid

Nisin和L-乳酸對嗜水氣單胞菌的生長參數(shù)影響見表1。在Nisin和L-乳酸協(xié)同處理下,兩株指示菌的生長延滯期、μmax值(最大比生長速率)以及OD600 max值(最大吸光值)均有所下降,且隨Nisin濃度越高,各項指標下降趨勢越明顯。另外,菌株CICC 10500和ATCC35654對Nisin的敏感性不同:在3.5 mmol/L L-乳酸存在時,0.05 g/L nisin使菌株ATCC 35654的延滯期從12.70 h提高至30.40 h,OD600 max值由1.60降低至1.30;而菌株CICC 10500的延滯期從1.73h提高至13.64 h,OD600 max值由14.93降低至0.08。

表1 Nisin在3.5 mmol/L乳酸存在時對嗜水氣單胞菌生長曲線主要參數(shù)的影響Table 1 Interference of nisin with the combination of 3.5 mmol/L L-lactic acid on the growth parameters of A. hydrophila

2.3 L-乳酸與Nisin對嗜水氣單胞菌的協(xié)同抑殺作用

采用活菌計數(shù)法分析Nisin與L-乳酸協(xié)同對嗜水氣單胞菌ATCC 35654和CICC 10500的抑殺作用。結果如圖3所示,Nisin單獨處理對菌體活菌數(shù)(7.2×109、7.1×109CFU/mL)較對照組(6.8×109、6.4×109CFU/mL)沒有顯著影響,3.5 mmol/L L-乳酸處理后活菌數(shù)(5.9×109,5.4×109CFU/mL)顯著低于對照組(P<0.05),但降低幅度不大。而對于復合組嗜水氣單胞菌而言,其活菌數(shù)(1.7×109,2.6×109CFU/mL)大幅下降且極顯著低于L-乳酸單獨處理組(P<0.01)。這表明Nisin與L-乳酸協(xié)同處理可引起嗜水氣單胞菌菌體細胞死亡,且具有顯著的殺傷效果。

圖3 Nisin和L-乳酸對嗜水氣單胞菌的協(xié)同抑殺作用Fig.3 Synergistic lethal effects of nisin and L-lactic acid on A. hydrophila

2.4 L-乳酸與Nisin抑制生物被膜的形成

圖4展示了乳酸和Nisin處理對嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響,對照組(圖4(1A)、圖4(2A))嗜水氣單胞菌的菌體大量成片聚集在爬片上,菌體密集,取出爬片時肉眼即可觀察到菌致密地粘附在玻片上。0.05 g/L Nisin處理組(圖4(1B)、圖4(2B))生物被膜的形成效果與對照組相似,有較多的菌體平鋪在爬片上。3.5 mmol/L L-乳酸處理后(圖4(1C)、圖4(2C)),菌體并沒有鋪滿整個視野,且在爬片表面形成一些空洞區(qū)域且結構較為松散。而乳酸和Nisin協(xié)同處理組(圖4(1D)、圖4(2D))的生物被膜,結構松散,不密集,也未觀察到較大的團塊狀結構。表明乳酸和Nisin協(xié)同處理對兩株嗜水氣單胞菌生物被膜的形成有抑制作用。

圖4 L-乳酸與Nisin對嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響(1000×)Fig.4 Effect of L-lactic acid and nisin on the biofilm formation of A. hydrophila(1000×)注:A:對照組;B:乳酸組;C:Nisin組;D:協(xié)同組。

2.5 L-乳酸處理對嗜水氣單胞菌外膜LPS釋放的影響

如圖5所示,經(jīng)L-乳酸處理8 h后,上清液中LPS特征吸收峰201 nm的吸光值與對照組(L-乳酸濃度為0 mmol)相比增加;且4 mmol/L L-乳酸處理組峰值最高,顯著高于其余處理組(P<0.05)。表明L-乳酸處理可能破壞了菌體外膜(細胞壁),使LPS釋放到上清液中。

圖5 不同濃度L-乳酸處理嗜水氣單胞菌后LPS釋放效果Fig.5 LPS released effect after the treatment of A. hydrophila with different concentrations of L-lactic acid

2.6 Nisin對L-乳酸處理后嗜水氣單胞菌細胞膜電動勢的影響

以嗜水氣單胞菌CICC 10500為代表檢測其經(jīng)過3.5 mmol/L L-乳酸處理后的膜電動勢變化(圖6)。在15 min的測定時間內(nèi),對照組菌液熒光強度逐漸下降,10 min時趨于平緩。Nisin處理熒光值一開始與對照組一致呈下降趨勢,但在6 min后逐漸升高。熒光探針DiSC3(5)富集在極化的細胞膜周圍,當插入細胞膜后熒光淬滅。如果熒光值增加,表明細胞膜電動勢消散。如圖6所示,Nisin使經(jīng)過L-乳酸處理的嗜水氣單胞菌菌體膜電動勢消散。這與Nisin作用于革蘭氏陽性敏感菌的機理類似。

圖6 乳酸與Nisin對菌體膜電動勢的影響Fig.6 The effects of lactic acid and nisin on electromotive force of bacterial membrane

3 討論

3.1 Nisin與L-乳酸對嗜水氣單胞菌有生長抑殺作用

本研究發(fā)現(xiàn)Nisin單獨處理對兩株嗜水氣單胞菌均無生長抑制或者致死作用,這與大部分報道類似,即Nisin對革蘭氏陰性菌的作用有限[34]。試驗顯示低濃度細菌素Nisin對嗜水氣單胞菌有小幅度的生長促進作用。目前尚未研究其機理,也沒有找到相關研究文獻。推測該類肽可能作為菌體生長的營養(yǎng)物質,或者作為信號物質影響菌體代謝,從而促進菌體生長。

單獨低濃度L-乳酸處理對兩株嗜水氣單胞菌具有一定的生長抑制作用。L-乳酸為弱酸,可以完整分子形式進入細胞,然后解離為質子,給細胞帶來毒性,并導致生長抑制和死亡[35],當以Nisin與L-乳酸協(xié)同處理嗜水氣單胞菌時,菌體的生長進一步受到抑制,致死率顯著升高(P<0.05),且抑制強度或者致死力隨著Nisin濃度的增加而提高。這種抑制率或致死率的濃度依賴性與Nisin對敏感陽性菌的作用相似[36]。通過Gomptz模型擬合生長曲線,發(fā)現(xiàn)Nisin和L-乳酸協(xié)同處理顯著延長了嗜水氣單胞菌的生長延滯期,降低了菌群的最大比生長速率和平臺期的最高活菌濃度。這一結果提示,當Nisin和低濃度L-乳酸共同存在時,可以有效延緩和限制嗜水氣單胞菌群體的增殖。關于L-乳酸與Nisin對革蘭氏陰性菌的協(xié)同抑制作用的報道很少。Nyk?nen等[22]研究發(fā)現(xiàn)含有Nisin的發(fā)酵物與乳酸對革蘭氏陰性菌—熒光假單胞菌及銅綠假單胞菌有協(xié)同抑制作用。此外,Nisin與有機酸對革蘭氏陽性菌,如單核增生李斯特菌[37]、無害李斯特氏菌[38]也有協(xié)同抑制作用。探討多種細菌素與乳酸對各類革蘭氏陰性病原菌的抑制作用,將有助于進一步了解細菌素和乳酸的協(xié)同抑菌能力。

3.2 Nisin與L-乳酸降低嗜水氣單胞菌的毒性

嗜水氣單胞菌易形成生物被膜,生物被膜對消毒劑[39]、抗生素[40]以及不良環(huán)境有較強的抵抗力,這一特征使其容易在食品加工器具表面附著,造成持續(xù)性的危害[36]。本文證明Nisin和L-乳酸可協(xié)同降低嗜水氣單胞菌形成的生物被膜量。本文用于研究被膜形成的初始菌密度較高(達到了在LB培養(yǎng)基中的成熟期最高值),可以排除Nisin和L-乳酸對菌體生長抑制而產(chǎn)生的對生物被膜形成的影響。推測二者協(xié)同干擾了菌體代謝,影響被膜形成過程中必須的信號物質,或者導致部分菌體死亡,使其無法參與生物被膜的形成。從抑制被膜形成的角度而言,Nisin和L-乳酸共同存在時更有利于降低嗜水氣單胞菌的毒性。

3.3 Nisin與L-乳酸協(xié)同抑制嗜水氣單胞菌的機理

細菌素的抑菌機制大致分為三類:抑制細胞壁的合成[41]、作用于細胞質膜[42]、影響細胞基因表達和蛋白質合成[33]。本研究所選用的Nisin可作用于革蘭氏陽性菌的細胞壁磷脂II,干擾細胞壁的合成[43],或作用于細胞質膜形成孔洞,破壞細胞膜電位[44-45],導致細胞生長抑制或者死亡。嗜水氣單胞菌的細胞壁(外膜)沒有Nisin的作用位點,因此Nisin最有可能作用于細胞質膜發(fā)揮作用。然而革蘭氏陰性菌細胞壁(外膜)有LPS保護,因此細菌素無法靠近細胞質膜。通過低濃度L-乳酸處理,發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌的外膜LPS釋放到上清液中。進一步用Nisin處理后,觀察到Nisin可以使經(jīng)過L-乳酸處理后的菌體膜電動勢消散。表明Nisin與L-乳酸協(xié)同抑制嗜水氣單胞菌的機理可能是:L-乳酸破壞嗜水氣單胞菌的細胞壁(外膜),使得Nisin能夠接觸到細胞質膜,進而發(fā)揮抑菌作用。另一方面,Nisin對細胞膜的破壞作用,可能進一步增強了L-乳酸進入菌體發(fā)揮作用。因為許多學者曾報道過Nisin通過提高膜的通透性而增強了一些細菌素如LysH5[46],抗生素對病原菌的抑制[47-48]。此外,有學者認為氫鍵在Nisin的抑菌作用中發(fā)揮了重要作用[49]。Adhikari等[50]利用夠可以產(chǎn)生氫鍵的有機酸與Nisin共同制備復合物,發(fā)現(xiàn)該復合物對敏感菌的抑制能力增強,但他們并未探討復合物對革蘭氏陰性菌的抑制作用。進一步分析Nisin與L-乳酸在溶液中是否發(fā)生相互影響,Nisin作用過程中在菌體上的定位,是否有錨定分子,Nisin作用后胞內(nèi)L-乳酸含量等,將有助于深入揭示Nisin與乳酸協(xié)同抑菌的機理。

4 結論

Nisin與低濃度L-乳酸可以協(xié)同抑制嗜水氣單胞菌生長,使菌體死亡,干擾生物被膜的形成,降低菌體毒力。協(xié)同作用機理可能是:L-乳酸破壞嗜水氣單胞菌的細胞壁(外膜),使Nisin能夠接觸到細胞質膜,進而發(fā)揮抑菌作用。進一步分析各類細菌素與L-乳酸對革蘭氏陰性病原微生物的抑制作用及機理,對被膜態(tài)革蘭氏陰性菌的控制作用,將進一步拓展細菌素和L-乳酸在食品生產(chǎn)、加工及保鮮中的應用范圍,為新型細菌素的設計或已知細菌素的新應用提供新思路。