李自良， 王家敏， 趙彩紅， 王美皓， 李 倬， 喬自林， 馬忠仁

(1. 西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心， 蘭州 730030 2. 西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730030 3. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730030)

MDCK(Madin-Daby Canine Kidney, MDCK)細(xì)胞由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織分離培育建立[1]。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認(rèn)的適于流感病毒復(fù)制的3種細(xì)胞系之一[2]。我國流感疫苗和禽流感疫苗生產(chǎn)主要采用雞胚生產(chǎn)工藝，但雞胚生產(chǎn)工藝存在生產(chǎn)周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染等諸多缺陷，如遇禽流感大規(guī)模暴發(fā)，雞胚的供應(yīng)存在很大問題[3-5]。若采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的工藝，將不受雞胚等天然因素的限制，且生產(chǎn)周期短，工藝簡單，如遇流感暴發(fā)會(huì)快速反應(yīng)，短時(shí)間內(nèi)可提供大量疫苗產(chǎn)品[6-8]。另外，貼壁型的傳代細(xì)胞可用細(xì)胞工廠規(guī)?；囵B(yǎng)，生產(chǎn)中可將細(xì)胞生長和病毒繁殖控制在最適條件范圍內(nèi)，提高細(xì)胞密度和病毒滴度，實(shí)現(xiàn)大批次量、小批間差，產(chǎn)品具有更好的穩(wěn)定性和安全性，大量節(jié)省勞動(dòng)力、生產(chǎn)場地和能源消耗，降低生產(chǎn)成本，與雞胚直接增殖病毒的細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞增殖病毒的工藝相比具有明顯優(yōu)勢[9-11]。血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營養(yǎng)物質(zhì)。在動(dòng)物血清中牛血清又是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分。在培養(yǎng)基中加入適量的牛血清，不僅可以有效促進(jìn)細(xì)胞的生長繁殖，還能夠縮短細(xì)胞的生長周期，從而加快疫苗的生產(chǎn)，提高疫苗的產(chǎn)量，為疫苗生產(chǎn)企業(yè)帶來更多的利益[21]。目前市場上血清種類繁多，因此研究不同種類的血清對細(xì)胞培養(yǎng)的影響并建立快速有效的血清篩選方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[22]。本研究通過國產(chǎn)胎牛血清、進(jìn)口胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清對MDCK細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)的對比試驗(yàn)，在短時(shí)間內(nèi)找到培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的最佳血清，以期為疫苗研發(fā)節(jié)約成本、節(jié)省時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞從ATCC引進(jìn)，引進(jìn)后由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心按《中國藥典》2010版的要求建立主細(xì)胞庫(MDCK-M-60，P60)和工作細(xì)胞庫(MDCK-W-63，P63)。

1.1.2 培養(yǎng)基 DEME(high-glucous)購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 血清 胎牛血清A(蘭州民海，批號(hào)20150715)；胎牛血清B(Hyclone，批號(hào)SV30087.02-NZJ1221)；新生牛血清C(蘭州民海，批號(hào)20150901)。使用時(shí)按10%(V/V)添加到培養(yǎng)基中。

1.1.4 主要試劑及儀器 0.25%胰蛋白酶(購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；0.2%臺(tái)盼藍(lán)(Sigma)；結(jié)晶紫染液；T75方瓶；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板；細(xì)胞工廠(1層、10層，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；生微倒置顯微鏡(Olympus,CKX-41)；CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher，3111型)；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國Countstar，IC1000)；細(xì)胞工廠觀察裝置(北京恒一，XBG-III)等。

1.2 方法

1.2.1 貼壁培養(yǎng)傳代穩(wěn)定性觀察

分別用含有10%A、B、C血清的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇MDCK工作庫細(xì)胞，待細(xì)胞生長至致密單層時(shí)，分別用含有3種類型血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)并連續(xù)傳代10代，傳代時(shí)細(xì)胞均按照1∶6比例，置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。每代細(xì)胞在24和48 h拍照觀察細(xì)胞形態(tài)、長勢及致密程度。

1.2.2 生長曲線及生長動(dòng)力學(xué)分析

取第4代3種類型血清培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，分別用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按有限稀釋法將混合均勻的MDCK貼壁細(xì)胞懸液稀釋至1×104個(gè)/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接1 mL細(xì)胞懸液。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h消化3孔計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。按照此方法，對培養(yǎng)至第6代、第9代的MDCK細(xì)胞重復(fù)該試驗(yàn)2次，計(jì)算3次平均值，繪制細(xì)胞生長曲線。并比較3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的最大増殖密度、倍增時(shí)間[12]、比生長速率和平均比生長速率[13]。

倍增時(shí)間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細(xì)胞數(shù)，Y為細(xì)胞最大増殖密度前一天的細(xì)胞數(shù)，T為培養(yǎng)時(shí)間。

比生長速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細(xì)胞密度，t為培養(yǎng)時(shí)間，n和n-1為2個(gè)取樣計(jì)數(shù)時(shí)間點(diǎn)。

1.2.3 貼壁率分析

貼壁率是指貼壁細(xì)胞在低細(xì)胞密度下的集落形成，也就是貼壁效率。是判斷不同類型血清對細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)之一。取第4代、第6代和第9代3種類型血清培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，按1.2.1所述方法將細(xì)胞稀釋至1×103個(gè)/mL，制成50 cells/4 mL的細(xì)胞懸液，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入4 mL的細(xì)胞懸液，并做平行3孔。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，出現(xiàn)集落后，用吸管吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗，無水甲醇固定，結(jié)晶紫染色。觀察并對細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

貼壁率(%)=(所形成集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.2.4 細(xì)胞工廠擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證

取第10代C血清培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且鋪滿單層的MDCK細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，擴(kuò)大培養(yǎng)至1層細(xì)胞工廠連續(xù)傳3代，加150 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，接種密度為(8～9)×104個(gè)/mL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，用上述方法，接種10層細(xì)胞工廠，加1.5 L細(xì)胞培養(yǎng)液，接種密度為(8～9)×104個(gè)/mL，每12 h用細(xì)胞工廠觀察臺(tái)觀察，待細(xì)胞長成致密單層后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)3代，觀察細(xì)胞生長情況并在長成致密單層時(shí)用0.25%的胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 貼壁培養(yǎng)傳代穩(wěn)定性觀察

分別用含有A、B、C血清復(fù)蘇MDCK工作庫細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，3種類型血清均能較好促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖，細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，細(xì)胞之間相互銜接或呈鑲嵌狀緊密排列。用A、B血清復(fù)蘇、培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)、長勢、致密程度無明顯差別；C血清復(fù)蘇、培養(yǎng)MDCK細(xì)胞效果較A血清、B血清略欠，但培養(yǎng)細(xì)胞生長穩(wěn)定。3種類型血清分別培養(yǎng)細(xì)胞至第4代、第6代和第9代，效果見圖1。

2.2 生長曲線及生長動(dòng)力學(xué)分析

3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生長曲線繪制如圖2所示，比生長速率見圖3，平均比生長速率見圖4，最大增殖密度和倍增時(shí)間見表2。細(xì)胞生長曲線均呈“S”型；平均比生長速率3種類型血清差異不顯著(P>0.05)；最大增殖密度和倍增時(shí)間胎牛血清均優(yōu)于新生牛血清。

圖1 3種類型血清分別培養(yǎng)MDCK細(xì)胞效果比較(100×)

圖2 3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞生長曲線

2.3 貼壁率分析

3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞均形成了有效的集落數(shù)，平均集落形成率為(83.84±0.58)%、(85.0±0.87)%、(71.32±0.59)%，進(jìn)口胎牛血清略高于國產(chǎn)胎牛血清差異顯著(P=0.02)、國產(chǎn)新生牛血清低于國產(chǎn)和進(jìn)口胎牛血清差異極顯著(P<0.0001)。集落的形成見圖5。貼壁率結(jié)果見圖6。

圖3 3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞比生長速率

* P<0.05

表2 3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞倍增時(shí)間和最大增殖密度

2.4 細(xì)胞工廠擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證

C血清在1層和10層細(xì)胞工廠中傳代培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞生長良好，排列緊密，不同代次MDCK細(xì)胞長成致密單層時(shí)細(xì)胞形態(tài)基本一致，細(xì)胞可為六角形或多角形，呈現(xiàn)“鋪路石樣”，傳代過程中細(xì)胞生長穩(wěn)定。在10層細(xì)胞工廠中以(8～9)×104個(gè)/mL密度接種不同代次MDCK細(xì)胞，從細(xì)胞傳代到長成致密單層所需時(shí)間為48～60 h，細(xì)胞密度為(40～50)×104個(gè)/mL。C血清細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞效果見圖7。

“*”P<0.05; “****”P<0.0001

24 h48 h1層細(xì)胞工廠10層細(xì)胞工廠(第2層)10層細(xì)胞工廠(第9層)

3 討論與結(jié)論

MDCK細(xì)胞目前廣泛運(yùn)用于多種病毒的擴(kuò)增和純化，如腺病毒、犬細(xì)小病毒、貓粒細(xì)胞缺少癥病毒、禽流感病毒等[2]。目前國際上已有幾家企業(yè)批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗[14]。我國目前還沒有自主研發(fā)的MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的流感疫苗上市，但有多家企業(yè)正在利用MDCK等細(xì)胞進(jìn)行流感疫苗的研發(fā)[15-17]。

在培養(yǎng)貼壁型MDCK細(xì)胞時(shí)，血清是最常用、最合適、最有效的培養(yǎng)基成分。血清選擇不當(dāng)，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢、連續(xù)傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長不穩(wěn)定，而且由于血清價(jià)格昂貴、大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)成本特別高。血清的選擇直接關(guān)系到研發(fā)進(jìn)度和疫苗企業(yè)生產(chǎn)效益。本試驗(yàn)針對以上問題，分別用貼壁培養(yǎng)、生長曲線和貼壁率試驗(yàn)，評價(jià)了國產(chǎn)胎牛血清、進(jìn)口胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清對MDCK貼壁細(xì)胞的促生長效果的影響，并進(jìn)一步用細(xì)胞工廠擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，MDCK細(xì)胞在國產(chǎn)新生牛血清中能連續(xù)傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)較穩(wěn)定。

本試驗(yàn)通過研究不同類型的牛血清對MDCK細(xì)胞培養(yǎng)效果的影響，不僅在短時(shí)間內(nèi)成功篩選出了培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的最佳血清，而且也為疫苗生產(chǎn)中MDCK細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)提供試驗(yàn)依據(jù)。這種快速有效的血清篩選方法為疫苗研發(fā)、生產(chǎn)大大縮短了時(shí)間，節(jié)約了疫苗企業(yè)生產(chǎn)的成本。

在已發(fā)表的文章中，有關(guān)在細(xì)胞工廠中連續(xù)傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證血清對MDCK貼壁細(xì)胞的促生長效果較少，本試驗(yàn)中采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)細(xì)胞，對規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞提供參考。連續(xù)傳代培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果證明，國產(chǎn)新生牛血清可連續(xù)傳代培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，細(xì)胞生長良好，排列緊密，不同代次MDCK細(xì)胞長成致密單層時(shí)細(xì)胞形態(tài)基本一致。相比于國產(chǎn)和進(jìn)口的胎牛血清，使用國產(chǎn)新生牛血清可大大降低生產(chǎn)企業(yè)的成本。

本試驗(yàn)中3種類型血清培養(yǎng)MDCK細(xì)胞均形成了有效的集落數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果表明進(jìn)口胎牛血清略高于國產(chǎn)胎牛血清(P=0.02)，國產(chǎn)新生牛血清低于國產(chǎn)和進(jìn)口胎牛血清差異極顯著(P<0.0001)。這可能與胎牛血清和新生牛血清兩者所含的激素及其他活性物質(zhì)等組份與比例不同有關(guān)[18]。如纖維黏連素、胰島素、α2巨球蛋白、胎球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血小板促生長因子、表皮細(xì)胞生長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子等在細(xì)胞培養(yǎng)中各自發(fā)揮的生理功能，還有待進(jìn)一步研究。另外，胎牛血清的免疫球蛋白含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于新生牛血清，胎牛的血清相對來說比較純，所以培養(yǎng)細(xì)胞的效果會(huì)更佳[19]。除此之外還可能是由于牛血清中存在大量的脂蛋白，貯存不當(dāng)會(huì)造成血清營養(yǎng)，價(jià)值的流失，導(dǎo)致給細(xì)胞供應(yīng)營養(yǎng)的能力減弱，造成了細(xì)胞的生長緩慢[20-21]。