胡海石 董 博 王德景 蘇亞娟 杜文功

1.廊坊市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （河北 廊坊，065000） 2.廊坊市開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 3.廊坊市中心血站檢驗(yàn)科

慢性乙型肝炎（CHB）的發(fā)病人群較廣，流行病學(xué)研究證實(shí)，CHB的發(fā)病率可達(dá)483～686／1萬(wàn)人［1］。特別是在部分流行區(qū)，CHB的發(fā)病率可進(jìn)一步上升［2］。在CHB的病情檢測(cè)指標(biāo)方面，部分研究者認(rèn)為乙型肝炎病毒大蛋白（HBV LP）的表達(dá)能夠評(píng)估患者的感染程度，HBV LP能夠通過(guò)激活上游基因的轉(zhuǎn)錄速度，提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響到HBV DNA的擴(kuò)增過(guò)程［3］。同時(shí)相關(guān)基礎(chǔ)方面的研究還認(rèn)為，HBV LP的上升能夠提高HBV突變的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致病毒耐藥或者臨床治療結(jié)局的惡化［4］。部分研究者報(bào)道了HBV LP的表達(dá)及其與CHB患者治療結(jié)局的關(guān)系，認(rèn)為HBV LP在評(píng)估HBV感染或者預(yù)后的過(guò)程中能夠發(fā)揮一定的作用［5］，但缺乏HBV LP與HBV DNA的對(duì)照分析。本研究探討了HBV LP的表達(dá)及其與HBV DNA的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年1月在廊坊市人民醫(yī)院治療的CHB患者89例，其中男59例，女30例；年齡36～67歲，平均（51.20±8.19）歲；病程9個(gè)月～16年，平均病程（8.39±2.01）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者［6］；②未合并其他肝炎病毒感染者；③初治患者；④患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有惡性腫瘤者；有肝臟手術(shù)史者。

1.2 治療方法 患者口服恩替卡韋（國(guó)藥準(zhǔn)字H20052237，正大藥業(yè)有限公司），0.5 mg，1次／d，連續(xù)3個(gè)月。治療過(guò)程中，對(duì)于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）或者天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）大于40 U／L的患者給予肝蘇顆粒或者飛利肝片保肝治療。

1.3 檢測(cè)方法 HBV DNA定量檢測(cè)：采集患者的血清5 ml，加入0.2m l的氯仿，2～8℃離心（12 000 g／min，15min），反復(fù)洗滌RNA，棄上清液，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1 ml 75% 乙醇，0.1% DEPC水溶解。加入HBV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20 pmol／μl，制備反應(yīng)體系。RT-PCR 擴(kuò)增條件與參數(shù)：48℃，45 min，94℃，2 min；94℃30 s，58℃60 s，68℃2 min，共40個(gè)循環(huán)；循環(huán)完畢后68℃延伸7 min。采集患者的靜脈血3 ml，加入HBV LP單抗，標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品中的HBV LP會(huì)與單抗結(jié)合，PBS液體洗滌5 min。按照1∶500的比例加入羊標(biāo)志的一抗5 m l，4℃放置過(guò)夜，PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min，加入鼠來(lái)源的二抗（1∶1 000）2 ml，室溫放置2 h，PBS液體洗滌5 min。加入顯色底物，辣根過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃。在450 nm處測(cè)OD值。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：病毒載量≥103拷貝／ml為陽(yáng)性。HBV LP陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：吸光度值≥0.105時(shí)為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者HBV LP、HBV DNA檢測(cè)情況 CHB患者HBV LP陽(yáng)性率89.89%（80／89），明顯高于HBV DNA的陽(yáng)性率78.65%（70／89），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.238，P＜0.05）。

2.2 CHB患者HBV LP與HBV DNA的關(guān)系 隨著HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值增加，HBV LP吸光度值明顯升高，其中HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值＞7的患者HBV LP吸光度值明顯高于其他患者（P＜0.05），見表1。相關(guān)性分析顯示，HBV LP吸光度值與HBV DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)（r＝0.846，P＜0.05），見圖1。

圖1 HBV LP與HBV DNA的相關(guān)性

2.3 CHB患者治療后HBV LP、HBV DNA陽(yáng)性率情況 70例HBV DNA陽(yáng)性患者給予抗病毒治療。治療24周時(shí)，HBV DNA和HBV LP陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療48周時(shí)，HBV LP陽(yáng)性率為48.57%，明顯高于HBV DNA的陽(yáng)性率（P＜0.05）。見表2。

表2 CHB患者治療后HBV LP、HBV DNA陽(yáng)性率比較 ［n（%）］

3 討論

性接觸、血源性感染等均能夠增加HBV的感染風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致遠(yuǎn)期肝功能損害，增加肝臟纖維化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，特別是在合并有自身免疫力下降的人群中，CHB感染的風(fēng)險(xiǎn)可進(jìn)一步的上升［7］。長(zhǎng)期的臨床隨訪研究發(fā)現(xiàn)，CHB感染后的病情遷延不愈的風(fēng)險(xiǎn)較高，疾病容易反復(fù)波動(dòng)。現(xiàn)階段臨床上主要通過(guò)HBV DNA來(lái)評(píng)估患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況，判斷抗病毒治療終點(diǎn)。但單純依靠HBV DNA指導(dǎo)CHB治療的準(zhǔn)確性較低，其評(píng)估停藥時(shí)機(jī)的靈敏度不足45%［8］。部分患者在HBV DNA轉(zhuǎn)陰、乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)陰后，病情仍然存在持續(xù)性進(jìn)展的潛在風(fēng)險(xiǎn)，部分患者體內(nèi)的乙肝病毒仍然存在低水平的復(fù)制［9］。

HBV表面抗原大蛋白前S區(qū)HBV LP的轉(zhuǎn)錄水平的差異，能夠顯著影響到下游DNA的擴(kuò)增或者復(fù)制過(guò)程。過(guò)度轉(zhuǎn)錄的HBV LP能夠通過(guò)其對(duì)啟動(dòng)子羧基末端的磷酸化修飾作用，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)錄區(qū)域啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)HBV DNA的過(guò)度釋放。HBV LP能夠通過(guò)其雙跨膜蛋白的重組結(jié)構(gòu)，通過(guò)反式調(diào)節(jié)機(jī)制，誘導(dǎo)HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞，激活宿主細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白激酶C系統(tǒng)，導(dǎo)致HBV DNA的持續(xù)性擴(kuò)增［10］?；A(chǔ)方面的研究還認(rèn)為，HBV LP的表達(dá)濃度的上升還能夠參與到HBV Dane顆粒的組裝和釋放，參與肝臟上皮細(xì)胞膜完整性的破壞［11］。部分研究者已經(jīng)探討了HBV LP的表達(dá)與CHB患者的病情關(guān)系，認(rèn)為HBV LP的表達(dá)上升與CHB患者的肝功能惡化密切相關(guān)［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者HBV LP陽(yáng)性率明顯高于HBV DNA陽(yáng)性率，提示在CHB患者體內(nèi)HBV LP的表達(dá)濃度可進(jìn)一步上升，同時(shí)也提示HBV LP的表達(dá)同樣也可能參與CHB患者的病情進(jìn)展。HBV LP的表達(dá)上升主要通過(guò)下列途徑影響病情進(jìn)展［13，14］。①HBV LP的上升能夠提高Dane病毒顆粒與宿主細(xì)胞整合效果，導(dǎo)致肝臟上皮細(xì)胞線粒體損傷程度的增加；②HBV LP的上升能夠激活HBV DNA的上游轉(zhuǎn)錄過(guò)程，提高HBV DNA的正向擴(kuò)增調(diào)控水平。張?zhí)K貞等［15］也探討了不同病情的CHB患者血清學(xué)資料，發(fā)現(xiàn)HBV LP的表達(dá)陽(yáng)性率可達(dá)75%以上，特別是早初次發(fā)病或者處于治療后病毒復(fù)制穩(wěn)定期的患者，HBV LP的表達(dá)陽(yáng)性率可進(jìn)一步上升。HBV DNA拷貝數(shù)量大于7的患者，血清HBV LP水平可進(jìn)一步上升，同時(shí)HBV LP與HBV DNA的表達(dá)具有顯著的相關(guān)關(guān)系，提示二者在促進(jìn)CHB病情進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮了重要協(xié)同作用。從原因上分析，這主要考慮與HBV LP的上調(diào)增加了HBV DNA的轉(zhuǎn)錄效能，導(dǎo)致上游C區(qū)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的增強(qiáng)，從而增加了HBV DNA的拷貝速度。但部分研究者并不認(rèn)為HBV LP與HBV DNA的表達(dá)具有普遍性，認(rèn)為只有在合并有明顯的CHB活動(dòng)期表現(xiàn)的患者中，二者的表達(dá)才具有顯著的線性關(guān)系，可能與HBV LP的檢測(cè)靈敏程度、CHB患者的基礎(chǔ)性病情差異較大有關(guān)。在治療隨訪的過(guò)程中，雖然在治療24周左右并未發(fā)現(xiàn)HBV LP與HBV DNA的表達(dá)差異，但隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，可以發(fā)現(xiàn)HBV LP的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于HBV DNA，提示HBV DNA維持低水平時(shí)，HBV LP的陽(yáng)性率仍然較高，此時(shí)的HBV LP檢測(cè)仍然具有較高的臨床指導(dǎo)價(jià)值。