崔夢君，鄒金，蔡文超，單春會，張振東，郭壯，*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

紅棗酒是一種以紅棗為原材料，經(jīng)預(yù)處理后，在酵母菌的作用下發(fā)酵而成的果酒，因具有酒精度低、營養(yǎng)價值高和色澤透亮的優(yōu)點而受到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。目前對其滋味[2]、氣味[3]和澄清度[4]方面的研究成果較多。氨基酸不僅能為微生物生長繁殖提供氮源，還可作為呈味物質(zhì)和呈香物質(zhì)的前體物質(zhì)[5]，進(jìn)而促進(jìn)發(fā)酵果酒的微生物生長繁殖，賦予果酒良好的滋味和風(fēng)味品質(zhì)。由此可見，研究紅棗酒的氨基酸種類及含量是有意義的。雖然紅棗的氨基酸種類較多，相關(guān)方面的研究成果較豐富[6-8]，但優(yōu)化紅棗酒氨基酸測定方法的研究較少。

氨基酸自動分析儀是一臺結(jié)合陽離子交換樹脂柱分離、茚三酮柱后衍生和可見光分光光度檢測為一體，能有效運用于氨基酸檢測的設(shè)備。目前，使用該儀器可有效檢測出荔枝酒[9]、桑葚酒[10]和獼猴桃酒[11]等果酒中10多種氨基酸，繼而實現(xiàn)其滋味品質(zhì)和蛋白質(zhì)質(zhì)量評價[12]。由此可見，使用氨基酸自動分析儀測定紅棗酒中氨基酸種類和含量有一定的可行性。

本研究結(jié)合鹽酸水解法和茚三酮柱后衍生離子交換色譜法，以柱溫度、流速和緩沖液時間為探討對象，建立紅棗酒氨基酸測定的方法，并基于該方法對靈寶棗（Zizyphus jujuba cv.Lingbaozao）、木棗（Zizyphus jujuba cv.Muzao）、圓鈴棗（Ziziphus jujuba cv.Yuanlingzao）、壺瓶棗（Ziziphus jujuba Mill cv.Dapingding）和石門棗（Ziziphus jujuba var.Inermis（Bunge）Rehd）釀造紅棗酒的氨基酸含量進(jìn)行測定，以期為后續(xù)紅棗酒滋味和營養(yǎng)品質(zhì)評價提供技術(shù)指導(dǎo)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

市售靈寶棗：河南省靈寶市；市售木棗：山西省呂梁地；市售圓鈴棗：山東省聊城市；市售壺瓶棗：山西省太谷市；市售石門棗：甘肅省白銀市；SY型葡萄酒果酒干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（5萬U/g）：和氏壁生物技術(shù)有限公司；偏重亞硫酸鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；食用級檸檬酸：河南千志商貿(mào)有限公司；葡萄糖、檸檬酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸、異丙醇、氯化鈉和無水乙醇：西隴化工股份有限公司；苯酚：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和緩沖液1、2、5、6：英國Biochrom公司。

KP-767破壁機：廣州市祈和電器有限公司；3-18k離心機：德國Sigma實驗室離心機股份有限公司；DKB-8A電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀：英國Biochrom公司；GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；FA3104N電子天平：上海菁海儀器有限公司；2XZ-4型旋片式真空泵：浙江黃巖天龍真空泵廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅棗酒的制備工藝

參考張潔等的工藝參數(shù)[13]，并稍加修改。將靈寶棗、木棗、圓鈴棗、壺瓶棗和石門棗洗凈去核后，分別稱取適量紅棗，加入4倍去離子水，破壁30 s后，加入0.03%果膠酶于45℃浸提2h。酶解后調(diào)糖度至24°Bx，pH值調(diào)節(jié)至3.80，并加入0.006%偏重亞硫酸鉀混合均勻后，接入0.03%酵母菌于20℃發(fā)酵11 d。果酒發(fā)酵結(jié)束后，使用8層紗布過濾，8 000 r/min離心5 min后取上清液備用。

1.2.2 紅棗酒樣品處理

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》中的蛋白水解法，分別取5種紅棗酒3 mL于水解管中，加入3 mL濃鹽酸后，再加入6 mol/L稀鹽酸至10 mL，并加入3滴～4滴苯酚混勻。將水解管置于冷凍劑中冷凍2 min～4 min后，抽真空1 min～3 min，再充入高純度氮氣，重復(fù)3次，在充氮氣的情況下，密封水解管，置于110℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中水解22 h后，冷卻至室溫（25℃）。將紅棗酒水解液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用去離子水定容至刻度線后，取1 mL于稱量瓶，使用蒸發(fā)儀在40℃～50℃環(huán)境下干燥，殘留物用1 mL去離子水溶解后，再次干燥。將二次干燥的殘留物溶于1 mL pH值為2.20的樣品稀釋緩沖液中，通過0.22 μm濾膜過濾制得樣品測定液備用。

1.2.3 紅棗酒氨基酸含量測定

將樣品瓶置于樣品架上，用20%異丙醇清洗進(jìn)樣針后，排管路氣泡，再導(dǎo)入方法文件對紅棗酒樣品測定液進(jìn)行檢測。方法文件設(shè)置為：進(jìn)樣體積為20 μL；稀釋度為1；層析的3個柱溫度為38、58、93℃；流速為35 mL/h；pH值為3.2的緩沖液1、pH值為4.25的緩沖液2、pH值為6.45的緩沖液5和緩沖液6（氫氧化鈉溶液）分別洗脫樣品6、12、20、4 min。因緩沖液3和4用于氧化蛋白水解物和生理體液的洗脫，在紅棗酒測試中并不使用，故不進(jìn)行詳細(xì)闡述。參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》中的要求，試樣氨基酸含量在1.00 g/100 g以下，保留2位有效數(shù)字。

1.2.4 分析柱溫度對氨基酸分離效果的影響

將5種棗制備的紅棗酒等比例混合均勻后上機測試，設(shè)置溫度程序分別 40、58、93℃；40、60、93℃；42、58、93℃；42、60、93℃。其他參數(shù)按步驟1.2.3中設(shè)置。

1.2.5 流速對氨基酸分離效果的影響

將5種棗制備的紅棗酒等比例混合均勻后上機測試，設(shè)置流速分別為 31、33、35、37 mL/h，溫度程序參考步驟1.2.4試驗結(jié)果，其他參數(shù)按步驟1.2.3設(shè)置。

1.2.6 緩沖液1洗脫時間對氨基酸分離效果的影響

將5種棗制備的紅棗酒等比例混合均勻后上機測試，設(shè)置緩沖液 1 洗脫時間為 5.83、6.00、6.17、6.33、6.50 min。溫度和流速參考試驗1.2.4和1.2.5的測試結(jié)果設(shè)置，其他參數(shù)按步驟1.2.3設(shè)置。

1.2.7 緩沖液2洗脫時間對氨基酸分離效果的影響

將5種棗制備的紅棗酒等比例混合均勻后上機測試，設(shè)置緩沖液2洗脫時間為12.00、12.17、12.33 min。其他參數(shù)參考試驗1.2.6的測試結(jié)果設(shè)置。

1.2.8 樣品測定液儲藏時間和溫度對氨基酸分離效果的影響

將5種棗制備的紅棗酒等比例混合均勻后分別置于4℃和-20℃儲藏90 h，測試按照試驗1.2.7所優(yōu)化的測試方法上機測試。

1.2.9 精密度試驗

采用1.2.7中優(yōu)化的測試方法，檢測已稀釋10倍的氨基酸混合液標(biāo)準(zhǔn)品，建立校準(zhǔn)文件后，重復(fù)測試紅棗酒樣品兩次，按如下公式計算樣品中氨基酸的含量。

1.2.10 5種紅棗酒的氨基酸定性定量分析

采用1.2.2中的方法處理5種紅棗酒，使用1.2.7中建立的方法進(jìn)行測試，并結(jié)合校準(zhǔn)文件對其定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析柱溫度對氨基酸分離效果的影響

建立4個柱溫程序，紅棗酒中的氨基酸與茚三酮結(jié)合的復(fù)合物在570 nm波長（檢測器1）和440 nm波長（檢測器2）處吸收峰色譜圖如圖1所示。

圖1 柱溫對紅棗酒氨基酸的影響Fig.1 Effects of column temperature on amino acids in red jujube wine

由圖1可知，紅棗酒樣品可檢測出18種物質(zhì)，因5號峰在檢測器2（440 nm）處響應(yīng)值較在檢測器1（570 nm）處靈敏，故后期將5號峰在檢測器2的響應(yīng)值納入分析，而其他峰均以在檢測器1處的響應(yīng)值進(jìn)行分析。由圖1亦可知，微調(diào)溫度并未對紅棗酒中氨基酸峰型產(chǎn)生影響，且由于大部分氨基酸的響應(yīng)值較小，所以從色譜圖中不易直觀發(fā)現(xiàn)溫度梯度的變化對氨基酸分離效果的影響。因此，本文結(jié)合各峰的分離度，對其進(jìn)行評價，結(jié)果如表1所示。

表1 柱溫對紅棗酒分離度的影響Table 1 Effect of column temperature on resolution in red jujube wine

由表1可知，8號峰和13號峰的分離度在四種溫度梯度作用下均較小。作為色譜柱分離樣品效果的評價指標(biāo)，分離度在1～1.5范圍內(nèi)能實現(xiàn)相鄰峰的基本分離，而分離度大于1.5時，相鄰峰完全分離[14]。當(dāng)柱溫設(shè)置為第四種時，即42、60、93℃的溫度梯度，8號峰能完全分離出來，13號峰相較之下分離效果更好。由此可見，紅棗酒的氨基酸含量測定方案應(yīng)選擇溫度梯度為 42、60、93 ℃。

2.2 流速對氨基酸分離效果的影響

由2.1的試驗結(jié)果可知，本研究選用42、60、93℃的溫度遞增趨勢作為分離紅棗酒中氨基酸的溫度程序，并在此基礎(chǔ)上，探討流速對其分離效果的影響。結(jié)果如表2所示。

表2 流速對紅棗酒分離度的影響Table 2 Effect of flow rate on resolution in red jujube wine

由表2可知，隨著流速增大，8號峰和13號峰的分離度均呈現(xiàn)下降趨勢，且在流速達(dá)到35mL/h以上時，分離度減少至1.5以下。值得一提的是，因儀器數(shù)據(jù)采集時間均為45 min，而以31 mL/h流速運轉(zhuǎn)時，18號峰數(shù)據(jù)并未完全采集完。由此可見，在實現(xiàn)峰較好的分離的情況下，考慮到節(jié)約測試時間和試劑，本研究最終選用紅棗酒氨基酸測試方法的流速為33 mL/h。

2.3 緩沖液洗脫時間對氨基酸分離度的影響

在結(jié)論2.2的基礎(chǔ)上，改變緩沖液1和緩沖液2的洗脫時間，探討對紅棗酒氨基酸的分離效果的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 緩沖液時間對紅棗酒分離度的影響Table 3 Effect of buffer time on resolution in red jujube wine

續(xù)表3 緩沖液時間對紅棗酒分離度的影響Continue table 3 Effect of buffer time on resolution in red jujube wine

由表3可知，隨著pH值為3.2的緩沖液1洗脫時間的延長，11號峰的分離效果逐漸降低，同時，考慮到8號峰能完全分離，則以6.00 min為最佳沖洗時間。由表3亦可知，當(dāng)設(shè)置pH值為4.25的緩沖液2洗脫時間為12.00 min時，8號峰分離度僅為1.003，而再延長0.17 min，則11號峰的分離度開始降低。由此可見，紅棗酒氨基酸的分離程序中緩沖液1和緩沖液2的沖洗時間應(yīng)分別以6.00 min和12.00 min為宜。此外，由Biochrom儀器使用手冊可知，緩沖液1和緩沖液2的時間影響絕大多數(shù)氨基酸的分離，因此，本文只將這兩種緩沖液納入分析研究中。

2.4 樣品測定液儲藏時間和溫度對氨基酸分離效果的影響

考慮到實際測試因素，本研究于儲藏前和儲藏30、60、90 h取樣上機測試，并以其保留時間作為紅棗酒中氨基酸質(zhì)量變化的評價指標(biāo)[15]，以期獲得紅棗酒樣品測定液存放時間和方式的最佳條件。試驗結(jié)果如表4所示。

表4 儲藏溫度和時間對氨基酸分離度影響Table 4 Effect of storage temperature and time on amino acid quality

由表4可知，于4℃儲藏的紅棗酒氨基酸的保留時間變化較大，僅僅只有少數(shù)峰經(jīng)60 h儲藏后其保留時間變化在1.5%的誤差范圍內(nèi)，而于-20℃儲藏的測定液在60 h內(nèi)氨基酸保留時間均在1.5%的誤差內(nèi)。由此可見，樣品測定液應(yīng)置于-20℃儲藏，且應(yīng)在60 h內(nèi)完成測試。

2.5 精密度試驗

在相同條件下對紅棗酒進(jìn)行兩次重復(fù)測試，利用標(biāo)準(zhǔn)品氨基酸的測試結(jié)果進(jìn)行定性定量分析，并以連續(xù)兩次的測試結(jié)果的絕對差值小于其平均值的12%為試驗數(shù)據(jù)精密度良好的評定標(biāo)準(zhǔn)。值的一提的是，紅棗酒共檢測出18個峰，而7、10、14號峰3個峰因未識別出而不納入分析，其他15個峰所對應(yīng)物質(zhì)及其含量如表5所示。

由表5可知，紅棗酒中含有14種氨基酸，且兩次測試結(jié)果的絕對差值均小于其平均值的12%，因此，全自動氨基酸分析儀運用于紅棗酒氨基酸含量測定的研究項目時，精密度符合國家標(biāo)準(zhǔn)文件。由此可見，將其運用于測試紅棗酒氨基酸種類和含量是可行的。

表5 精密度試驗Table 5 Precision experiment

2.6 5種紅棗酒氨基酸含量測定

取以靈寶棗、木棗、圓鈴棗、壺瓶棗和石門棗為原料發(fā)酵的紅棗酒作為測定液進(jìn)行上機測試，并計算所含必需氨基酸的含量和其占氨基酸總量的比例，其結(jié)果如表6所示。

由表6可知，5種紅棗酒均檢測出14種氨基酸，均以脯氨酸含量最高，其次為天冬氨酸和谷氨酸，而丙氨酸和組氨酸最少。其中，圓鈴紅棗酒的氨基酸含量最高，14種氨基酸含量均在1 μg/mL以上，總量達(dá)到283.76 μg/mL。此外，5種紅棗酒均檢測出4種必需氨基酸，含量在7 μg/mL以上，而圓鈴紅棗酒的必需氨基酸含量高于其他紅棗酒，但僅占總氨基酸的5.26%，相反，木棗酒中必需氨基酸占氨基酸總量的比例最高，達(dá)到7.23%。因必需氨基酸含量影響蛋白質(zhì)的質(zhì)量[16]，因而以木棗酒的蛋白質(zhì)價值較高。

表6 5種紅棗酒氨基酸種類和含量Table 6 Amino acid types and contents of five red jujube wines

續(xù)表6 5種紅棗酒氨基酸種類和含量Continue table 6 Amino acid types and contents of five red jujube wines

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在溫度程序為42、60、93℃，流速為33 mL/h，緩沖液1和緩沖液2分別洗脫6 min和12 min的條件下，紅棗酒中氨基酸能得到較好的分離效果，且置于-20℃存放60 h以內(nèi)，其保留時間的誤差在允許范圍內(nèi)。研究亦發(fā)現(xiàn)，在此優(yōu)化的測試條件下測得5種紅棗發(fā)酵的紅棗酒均含有14種氨基酸，以脯氨酸含量最高。此外，5種紅棗發(fā)酵的紅棗酒均含有4種必需氨基酸，其中以木棗發(fā)酵紅棗酒必需氨基酸占總氨基酸的比例最高。