謝宗會(huì)，蔣昌河，萬(wàn)成杰，張春菁，楊再昌*

0 引言

結(jié)核病主要是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，根據(jù)世界衛(wèi)生組織《2019年結(jié)核病報(bào)告》，結(jié)核病仍是全球十大死亡原因之一，2018年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬(wàn)[1]。吡嗪酰胺是一種重要的一線抗結(jié)核病藥物，使用吡嗪酰胺可使結(jié)核治療時(shí)間由9個(gè)月縮短到6個(gè)月[2]，該藥可滲透入吞噬細(xì)胞，并進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌菌體內(nèi)，菌體內(nèi)的酰胺酶使其脫去酰胺基轉(zhuǎn)化為吡嗪酸而發(fā)揮抗菌作用；吡嗪酰胺可以殺死存在于酸性環(huán)境中的半休眠菌群[3]，在pH值為5～5.5時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌抑制作用最強(qiáng)，在人體中的最低抑菌濃度為12.5 μg/ml，當(dāng)濃度達(dá)到50 μg/ml時(shí)，可以在體內(nèi)直接殺死結(jié)核分枝桿菌[4]。本實(shí)驗(yàn)是在中性條件下進(jìn)行的。

異煙肼對(duì)代謝旺盛的結(jié)核菌具有強(qiáng)大的殺菌作用，但是不能殺死代謝靜止期的結(jié)核桿菌，而吡嗪酰胺對(duì)靜止期的結(jié)核桿菌有殺菌作用[5]，因此，吡嗪酰胺在結(jié)核治療中具有不可替代的作用。然而，在臨床應(yīng)用中吡嗪酰胺存在明顯的缺點(diǎn)，與其他一線抗結(jié)核桿菌藥物相比(如異煙肼，其體外MIC值為0.061 μg/ml)，吡嗪酰胺的體外MIC值(50～120 μg/ml)高，必須大劑量給藥才能發(fā)揮治療作用，相關(guān)研究表明，長(zhǎng)期大劑量服用吡嗪酰胺會(huì)導(dǎo)致明顯的肝毒性，若不及時(shí)進(jìn)行保肝治療可導(dǎo)致患者死亡[5-6]。因此，尋找能夠增強(qiáng)吡嗪酰胺活性的分子對(duì)結(jié)核治療具有重要意義，這類分子一方面可能對(duì)吡嗪酰胺的殺菌活性起增強(qiáng)或協(xié)同作用，另一方面能減少吡嗪酰胺的用藥量，從而降低吡嗪酰胺的肝毒性。

在古代醫(yī)藥典籍中，結(jié)核稱為“尸疰”、“鬼疰”、“癆瘵”、“肺癆”等，《肘后備疾方》里記載桑白皮、車前子、柴胡、當(dāng)歸治療尸疰、鬼疰，《衛(wèi)生寶鑒》記載烏梅治肺瘵，《世醫(yī)得效方》記載地黃、茯苓治癆瘵，《醫(yī)宗金鑒》記載赤芍、桂枝治肺癆，偏方“二麻四仁湯”治肺癆，方中杏仁為主藥，文獻(xiàn)報(bào)道大黃、木香、三棱、莪術(shù)、蒼術(shù)對(duì)結(jié)核能發(fā)揮一定治療作用[7-10]?；谏鲜鑫墨I(xiàn)記載和報(bào)道，選擇桑白皮、桂枝、車前子、地黃、烏梅、茯苓、大黃、苦杏仁、當(dāng)歸、柴胡、木香、京三棱、蒼術(shù)、莪術(shù)、赤芍共15種中藥作為試驗(yàn)藥材，采用改良羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法，體外測(cè)試了15種中藥醇提物與吡嗪酰胺的協(xié)同抗結(jié)核桿菌活性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 桑白皮、桂枝、車前子、地黃、烏梅、茯苓、大黃、杏仁、當(dāng)歸、柴胡、木香、京三棱、蒼術(shù)、莪術(shù)、赤芍購(gòu)自貴陽(yáng)市中藥材公司；吡嗪酰胺購(gòu)自百靈威科技有限公司。

1.2 菌株及培養(yǎng)基 所用試驗(yàn)菌株為牛結(jié)核分枝桿菌BCG菌株，購(gòu)自ATCC(ATCC35734)。

1.3 試劑 常規(guī)化學(xué)試劑(均為分析純)購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；改良羅氏培養(yǎng)基，購(gòu)自上海博微生物科技有限公司。

1.4 儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號(hào)R-3，瑞士Buchi公司；桌上式垂直凈化工作臺(tái)，型號(hào)VD-650，佰輝公司；普通電熱套，型號(hào)DRT-4，北京市光明醫(yī)療儀器廠；高速多功能粉碎機(jī)，型號(hào)WJX-100，上海緣沃工貿(mào)有限公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 中藥材提取物的制備 取桑白皮、桂枝、車前子、地黃、烏梅、茯苓、大黃、杏仁、當(dāng)歸、柴胡、木香、京三棱、蒼術(shù)、莪術(shù)、赤芍15種中藥材，分別粉碎至20目左右的粗粉，用75%的乙醇萃取，按照藥材與乙醇1∶5的比例放入1 000 ml的圓底燒瓶里，采用熱回流法提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓回收乙醇后，置蒸發(fā)皿蒸干，得到15種中藥材乙醇提取物，置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 吡嗪酰胺抑菌活性測(cè)定 改良羅氏培養(yǎng)基40.84 g，加入12 ml甘油，加蒸餾水600 ml煮沸5～10 min，115 ℃滅菌20 min，待冷卻至55 ℃左右加入1 000 ml攪勻的全蛋液，混勻，分裝在15 mm×150 mm的試管，每管5 ml[11](置于烘箱中高溫滅菌1 h)。稱取一定量的吡嗪酰胺，用二甲基亞砜溶解，制成10 mg/ml的母液，高壓滅菌后用微量進(jìn)樣器加入上述改良羅氏培養(yǎng)基中，得到吡嗪酰胺濃度分別為60、120、240、480、960 μg/ml的含藥培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做3管。陰性對(duì)照組為只加二甲基亞砜(<0.5%)的無(wú)藥培養(yǎng)基。試管放置成斜面，在80 ℃的凝固器中滅菌1 h。待培養(yǎng)基冷至室溫，每管分別接種牛結(jié)核分枝桿菌懸液50 μl (106CFU/ml)。接種后的試管放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)20 d后觀察結(jié)果。抑菌試驗(yàn)結(jié)果判定如下：菌落數(shù)低于8個(gè)(含8個(gè))計(jì)為有抑菌活性。其中，無(wú)菌落生長(zhǎng)計(jì)“+ + + +”，1～2個(gè)菌落計(jì)“+ + +”，3～5個(gè)菌落計(jì)“+ +”，6～8個(gè)菌落計(jì)“+”，菌落數(shù)超過(guò)8個(gè)視為無(wú)抑菌活性，計(jì)“-”。

1.5.3 中草藥醇提物抑菌活性測(cè)定 15種中草藥乙醇提取物均用二甲基亞砜溶解，加入改良羅氏培養(yǎng)基中，除桂枝醇提物濃度為0.5 mg/ml外，其余14種中藥醇提物的終濃度均為1 mg/ml，每個(gè)樣本做3管，空白對(duì)照組為只加二甲基亞砜的培養(yǎng)基。其余同上法。

1.5.4 吡嗪酰胺與15種中草藥醇提物的聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 按上述方法制備同時(shí)含吡嗪酰胺和中草藥醇提物的含藥斜面培養(yǎng)基，吡嗪酰胺的終濃度為60 μg/ml，除桂枝醇提物濃度為0.5 mg/ml外，其余14種中藥醇提物的終濃度均為1 mg/ml，按上法滅菌、接種、培養(yǎng)和進(jìn)行結(jié)果判斷。

2 結(jié)果

2.1 吡嗪酰胺抑菌活性結(jié)果 吡嗪酰胺的抑菌作用見(jiàn)表1，測(cè)出吡嗪酰胺對(duì)牛結(jié)核桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為120 μg/ml。

表1 吡嗪酰胺對(duì)牛結(jié)核桿菌的體外抑菌活性(μg/ml)

2.2 15種中藥乙醇提取物及與吡嗪酰胺聯(lián)合的抗菌測(cè)試結(jié)果 15種中藥乙醇提取物及與吡嗪酰胺聯(lián)合的抑菌作用見(jiàn)表2。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桂枝醇提物為1 mg/ml時(shí)，具有抑制牛結(jié)核桿菌的作用，故在聯(lián)合抗菌試驗(yàn)時(shí)，將其濃度降至0.5 mg/ml，其余14種中藥醇提物在1 mg/ml均無(wú)抗牛結(jié)核桿菌活性。從表2看出，共9種中藥與吡嗪酰胺存在聯(lián)合抗菌作用，按照抑菌強(qiáng)度，依次為桂枝、桑白皮、烏梅、茯苓、大黃、當(dāng)歸、柴胡、木香、莪術(shù)。

表2 15種中藥乙醇提取物及與吡嗪酰胺聯(lián)合對(duì)牛結(jié)核桿菌的體外抑菌活性

3 討論

分枝桿菌屬(Mycobacterium)包含不同種類的分枝桿菌，其中結(jié)核桿菌分為人型結(jié)核分枝桿菌和牛型結(jié)核分枝桿菌，這兩類分枝桿菌可在人和牛之間交叉感染。出于生物安全考慮，國(guó)內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)在篩選抗結(jié)核桿菌藥物時(shí)，一般采用牛結(jié)核桿菌BCG菌株或人結(jié)核桿菌H37Ra無(wú)毒株進(jìn)行初篩[12]。

吡嗪酰胺是一種前藥，在結(jié)核桿菌內(nèi)被轉(zhuǎn)化成吡嗪酸，在pH 5.5的酸性環(huán)境中產(chǎn)生殺菌作用[13]。體外抗人型結(jié)核桿菌試驗(yàn)，在中性環(huán)境中吡嗪酰胺抑制人型結(jié)核桿菌的MIC值為100 μg/ml[12]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)出吡嗪酰胺在中性環(huán)境中抗牛結(jié)核桿菌的最小抑菌濃度為120 μg/ml。異煙肼體外抑制牛結(jié)核桿菌的MIC值為0.06～0.12 μg/ml，與異煙肼比較，結(jié)核桿菌不管是人型還是牛型，對(duì)吡嗪酰胺都缺乏敏感性。因此，將牛結(jié)核桿菌作為試驗(yàn)菌株，對(duì)篩選能增強(qiáng)吡嗪酰胺抑菌作用的中草藥是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

當(dāng)吡嗪酰胺濃度降低到60 μg/ml時(shí)，牛結(jié)核桿菌生長(zhǎng)良好，在同等濃度(60 μg/ml)含吡嗪酰胺的培養(yǎng)基中分別再加入桂枝、桑白皮、烏梅、茯苓、大黃、當(dāng)歸、柴胡、木香、莪術(shù)的醇提物后，牛結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)完全被抑制，表明這9種中藥能增強(qiáng)吡嗪酰胺的抗菌作用。后續(xù)工作中，擬采用活性跟蹤分離方法對(duì)桂枝、桑白皮、烏梅等中藥進(jìn)行深入研究，分離、鑒定與吡嗪酰胺具有協(xié)同抗菌作用的活性分子，為發(fā)現(xiàn)新型抗結(jié)核桿菌藥物奠定基礎(chǔ)。