梁鞏 張強(qiáng) 郭旭川 陳慧颯 王艷萍 曾維斌

摘要：為比較驢血清和胎牛血清對(duì)體外培養(yǎng)驢巨噬細(xì)胞的影響，采用含10%驢血清或胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行驢巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)比試驗(yàn)，分別在培養(yǎng)的1、4、7、10 d時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，并用MTT法通過(guò)細(xì)胞吸光度檢測(cè)細(xì)胞活力;培養(yǎng)后4 d采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞的純度。結(jié)果表明，含10%驢血清培養(yǎng)液培養(yǎng)的驢巨噬細(xì)胞的分化能力優(yōu)于胎牛血清;培養(yǎng)后1、4 d時(shí)，2種血清對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響沒(méi)有顯著差異，但培養(yǎng)后7、10 d，驢血清組的細(xì)胞活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組;培養(yǎng)后4 d，2組試驗(yàn)中巨噬細(xì)胞的純度分別為（92.72±0.45）%和（81.16±2.13）%。綜上，驢血清組培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞其分化能力、活力和純度均優(yōu)于胎牛血清組，故更適合用于驢巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：驢;MTT法;同源血清;異源血清;巨噬細(xì)胞;分化能力;活力;純度;體外培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S822.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0072-04

收稿日期：2019-07-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31760643）;石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（編號(hào)：RCZX201501）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（編號(hào)：HS201504）。

作者簡(jiǎn)介：梁鞏（1993—），男，新疆且末人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖與生物技術(shù)。E-mail：2731327322@qq.com。

通信作者：曾維斌，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖與生物技術(shù)。E-mail：zwbdky@126.com。血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)及繁殖的能力是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中評(píng)價(jià)血清質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，血清的選擇對(duì)于細(xì)胞的培養(yǎng)有非常重要的意義[1]。血清中由于含有多種促細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分及細(xì)胞因子，因此成為體外細(xì)胞培養(yǎng)液中的常用添加成分，其對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)意義重大。細(xì)胞培養(yǎng)液中，常用的血清主要來(lái)源于牛、豬、雞等，其中胎牛血清因其獲得量大、污染相對(duì)較小而得到廣泛地應(yīng)用，但不同來(lái)源的血清對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)效果各有差異[2-3]，來(lái)自同種動(dòng)物的同源血清體外培養(yǎng)的細(xì)胞，其分化能力與貼壁能力均顯著優(yōu)于異源血清培養(yǎng)的細(xì)胞，另外同源血清的應(yīng)用可減少向培養(yǎng)液中添加較為昂貴的細(xì)胞生長(zhǎng)因子[4-6]。

巨噬細(xì)胞作為重要的免疫細(xì)胞，是機(jī)體免疫反應(yīng)的第1道防線[7-8]。它也參與穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，包括纖維化、脂質(zhì)代謝和組織重塑[9]，巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)可為免疫學(xué)研究提供基礎(chǔ)的細(xì)胞材料。目前，有大量試驗(yàn)對(duì)牛、鼠、猴等巨噬細(xì)胞進(jìn)行研究[1，4，6]，但有關(guān)驢巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究以驢外周血來(lái)源的巨噬細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，比較含10%驢同源血清與10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)體外驢巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的影響，以便建立一種體外培養(yǎng)驢外周血單核巨噬細(xì)胞的方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑淋巴細(xì)胞分離液、MTT試劑盒、青霉素鏈霉素混合溶液，均購(gòu)自于Solarbio公司;DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液，均購(gòu)自于Gibco公司;M、CD14抗體（美國(guó)BD公司）。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物新疆石河子大學(xué)試驗(yàn)站驢場(chǎng)體質(zhì)量一致、體況較好的新疆母驢。

1.2方法

1.2.1驢血清的制備選擇健康母驢3頭，采用真空無(wú)抗凝劑采血管于頸靜脈采集全血，室溫靜置 30 min，3 000 r/min離心10 min，取淡黃色上清液，采用0.22 μm濾菌器過(guò)濾除菌，56 ℃水浴15 min，最后冷凍保存于-20 ℃下。

1.2.2外周血單核細(xì)胞（PBMCs）的分離、培養(yǎng)將采集的全血用磷酸緩沖鹽溶液（PBS緩沖液）等倍稀釋混勻后，緩慢加到淋巴細(xì)胞分離液上層（兩者的體積比為1 ∶1），1 800 r/min 離心30 min，采用移液器吸取血漿稀釋液與淋巴細(xì)胞液中間的PBMCs層，將獲得的PBMCs用PBS緩沖液等倍稀釋混勻，1 000 r/min離心10 min，去除上清液，將沉淀的PBMCs再用PBS緩沖液洗1次，最后采用DMEM培養(yǎng)液清洗1次后將沉淀的PBMCs用培養(yǎng)液混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞的濃度，將PBMCs置于含10%驢同源血清或胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，約為1×105個(gè)/孔，4 h后吸棄細(xì)胞液，除去未貼壁細(xì)胞，在加入含血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)并定時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)。每隔2 d更換相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液。

1.2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活力在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)后1、4、7、10 d，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加90 μL新鮮含血清DMEM培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，然后吸棄上清，加入110 μL甲臜（formazan）溶解液，置于搖床低速振蕩10 min，然后采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔的吸光度（D490 nm）。

1.2.4巨噬細(xì)胞純度的檢測(cè)在細(xì)胞培養(yǎng)后4 d，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS緩緩沖洗2遍貼壁細(xì)胞;然后加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞絕大部分懸浮收縮變圓后，分別加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)液終止消化;離心收集所有細(xì)胞，加 400 μL PBS緩沖液混勻，再加入CD14抗體15 μL（空白組未加），在4 ℃冰箱中避光孵育30 min，1 000 r/min 離心5 min棄液，再用PBS混勻、離心洗滌2次;最后每管加入PBS 400 μL重懸細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的純度（CD14表達(dá)陽(yáng)性率）。

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件的單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05或P<0.01分別表示數(shù)據(jù)間差異顯著或極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1不同血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響

由圖1可知，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)1 d時(shí)2組細(xì)胞形態(tài)均為顆粒狀且數(shù)量很多。在細(xì)胞培養(yǎng)后4 d，胞體明顯增大，細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)分化，胞體由顆粒狀向長(zhǎng)梭狀或不規(guī)則形狀生長(zhǎng)，眼觀2組間無(wú)太大差異。然而在培養(yǎng)后7 d，2組均可見(jiàn)偽足出現(xiàn)（箭頭所指方向），且驢血清組的分化能力優(yōu)于胎牛血清組，另外2組細(xì)胞數(shù)量相比于培養(yǎng)后1 d明顯減少。在細(xì)胞培養(yǎng)后10 d，驢血清組的分化更加成熟，但胎牛血清組中的細(xì)胞無(wú)論是分化能力還是數(shù)量均在下降。

2.2不同血清對(duì)細(xì)胞活力的影響

由圖2可知，經(jīng)MTT法檢測(cè)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，2組的細(xì)胞活力均在逐漸降低。培養(yǎng)后4 d的2組細(xì)胞活力均顯著低于培養(yǎng)后1 d的細(xì)胞活力（P<0.05），且胎牛血清組在培養(yǎng)后1、4、7、10 d的細(xì)胞活力均有顯著差異（P<0.05）。

培養(yǎng)后1、4 d，2組的巨噬細(xì)胞活力沒(méi)有顯著差異，但在培養(yǎng)后7、10 d，驢血清組的細(xì)胞活力均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于胎牛血清組。

2.3驢巨噬細(xì)胞純度的檢測(cè)

由圖3可知，采用含10%驢同源血清、胎牛血清培養(yǎng)的驢巨噬細(xì)胞4 d CD14表達(dá)陽(yáng)性率分別為（92.72±0.45）%、（81.16±2.13）%，驢同源血清培養(yǎng)的驢巨噬細(xì)胞 CD14表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于胎牛血清培養(yǎng)的驢巨噬細(xì)胞。

3討論與結(jié)論

巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)和宿主防御中發(fā)揮核心作用，促進(jìn)先天免疫的建立，所以它得到了廣泛研究[7-9]。分離培養(yǎng)單核巨噬細(xì)胞的方法多種多樣，如從骨髓、腹腔、外周血中均可成功地分離培養(yǎng)巨噬細(xì)胞[10-12]。從外周血中分離出來(lái)的單核細(xì)胞具有很強(qiáng)的貼壁能力，而且容易在體外誘導(dǎo)分化為單核巨噬細(xì)胞。這種通過(guò)外周血單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞已被廣泛用于科學(xué)研究工作中，是一種普遍被科研工作者接受的原代巨噬細(xì)胞模型。楊菲菲

利用不同仔豬血清濃度體外培養(yǎng)金華豬細(xì)胞表明，在10%仔豬血清濃度培養(yǎng)的細(xì)胞其傳代活力強(qiáng)、增殖迅速，含10%血清濃度的培養(yǎng)液更適合原代細(xì)胞的培養(yǎng)[13]，因此本試驗(yàn)采用含10%血清濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。體外培養(yǎng)恒河猴外周血單核巨噬細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，猴同源血清優(yōu)于胎牛血清[6]，貼壁細(xì)胞分化能力更強(qiáng)，胞體由顆粒狀向長(zhǎng)梭狀或不規(guī)則形狀生長(zhǎng)，胞體由顆粒狀逐漸伸出偽足，說(shuō)明該方法培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞已經(jīng)具備了巨噬細(xì)胞的基本特征[14]。以上結(jié)論與本試驗(yàn)相一致，表明同源血清比異源血清更能誘導(dǎo)細(xì)胞的分化能力?？赡苡捎谘鍍?nèi)含有各種刺激或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在一定程度上起著保持或改變細(xì)胞生物學(xué)特性的作用[15]。

細(xì)胞相對(duì)衰減是衡量血清相對(duì)促細(xì)胞生長(zhǎng)作用的一種評(píng)價(jià)方法[16]。在研究其他外周血單核巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)的前幾天是細(xì)胞的適應(yīng)期，細(xì)胞數(shù)量變化比較大。一方面，細(xì)胞從體外分離過(guò)程中受到損傷并且要適應(yīng)新的環(huán)境，所以有大量的細(xì)胞死亡。另一方面，在換液的過(guò)程中淋巴細(xì)胞被洗棄了。因此，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力逐漸下降，并且剛開(kāi)始下降速度差異比較大[16-18]。沈前程等采用MTT法檢測(cè)培養(yǎng)貼壁單核巨噬細(xì)胞的相對(duì)活力，結(jié)果顯示，貼壁細(xì)胞體外培養(yǎng)72～120 h時(shí)，細(xì)胞數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，組間差異不顯著（P>0.05）[18]。本研究也采用MTT法檢測(cè)驢巨噬細(xì)胞活力，結(jié)果表明，細(xì)胞在培養(yǎng)后4、7 d，兩者差異不顯著，因此可在細(xì)胞培養(yǎng)后4～7 d這一相對(duì)平穩(wěn)期開(kāi)展后續(xù)的試驗(yàn)研究。

林煒明等在用10%人血清及人M-CSF培養(yǎng)人外周血巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫磁珠分選后得到CD14的陽(yáng)性率為85.5%[19]。盡管這些方法也能分離出巨噬細(xì)胞，但分離出來(lái)的成本更高，因此本試驗(yàn)采用同源血清進(jìn)行培養(yǎng)，省去無(wú)需添加生長(zhǎng)因子和免疫磁珠分選等步驟，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)的單核巨噬細(xì)胞純度為（92.72±0.45）%。猴巨噬細(xì)胞在培養(yǎng)后4、7 d的CD14細(xì)胞的陽(yáng)性率分別為（91.7±2.33）%、（96.4±1.93）%[6]，本研究結(jié)果與之相似，表明同源血清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞是一種可行的方法。

綜上所述，驢血清組培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的分化能力、活力和純度均優(yōu)于胎牛血清組，故更適合于驢巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而究竟同源血清中哪幾種成分起了重要的作用，還須作進(jìn)一步相關(guān)試驗(yàn)研究。

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