霍穎倩 衣香明 賈 瑞

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 山東 濱州 256603

文獻(xiàn)證明，腦組織缺血或出血等局部微環(huán)境的變化，會(huì)導(dǎo)致microRNA表達(dá)異常，引起相關(guān)靶基因表達(dá)異常。miR-98在許多組織內(nèi)均有表達(dá)，但miR-98在腦組織內(nèi)的表達(dá)及調(diào)控鮮見報(bào)道。腦缺血損傷早期，小膠質(zhì)細(xì)胞活化可發(fā)揮一定的神經(jīng)保護(hù)作用，但小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化后可產(chǎn)生一系列炎癥因子或介質(zhì)介導(dǎo)神經(jīng)元退行性變。因此，研究者應(yīng)盡量誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，限制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化導(dǎo)致的神經(jīng)毒性作用[1]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化、調(diào)控細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的受體或蛋白分子、拮抗其產(chǎn)生的神經(jīng)毒性因子、促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)保護(hù)性物質(zhì)、阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)等，將為腦缺血治療提供新思路。我們采用pre-hsa-miR-98轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞，觀察了轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞活化調(diào)控及調(diào)亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 Pre-hsa-miR98質(zhì)粒HmiR和連接隨機(jī)序列的質(zhì)粒CmiR購自廣州復(fù)能基因有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomiga公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)購自Amresco公司。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光)，購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BV-2細(xì)胞培養(yǎng)參見文獻(xiàn)[2]

1.2.2 HmiR和CmiR質(zhì)粒擴(kuò)增和提取 HmiR(貨號: HmiR0378MR04)為非病毒性載體, 啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)，具有嘌吟霉素抗性，報(bào)告基因eGFP，連接hsa-miR-98前體序列、載體構(gòu)建圖譜及轉(zhuǎn)染方法，見文獻(xiàn)[3]。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1d將BV-2細(xì)胞接種于6孔板,嚴(yán)格按照 Lipofectamine 2000說明書介紹將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、HmiR組和CmiR組。

1.2.4 轉(zhuǎn)染率檢測、細(xì)胞計(jì)數(shù)及增殖率檢測 倒置熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染率，MTT法檢測細(xì)胞增殖率，詳細(xì)步驟及操作方法見文獻(xiàn)[3]。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測 嚴(yán)格按檢測試劑盒說明操作。主要步驟：收集細(xì)胞，PBS洗滌。在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)，用免疫染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30 min。PBS洗滌，免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)重懸細(xì)胞，室溫孵育5 min。加入50 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS洗2次。PBS懸浮，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染率檢測結(jié)果 熒光顯微鏡下顯示，質(zhì)粒帶綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光，見圖1。計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)百分比計(jì)算轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染率結(jié)果見圖2。熒光顯微鏡計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組和對照組的轉(zhuǎn)染率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該質(zhì)?？梢杂糜诒緦?shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖率檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染48 h后, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率同轉(zhuǎn)染24 h組比較略微降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)染72 h后, 細(xì)胞增殖率達(dá)到最低。轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞之間的增殖率同轉(zhuǎn)染24 h相比明顯降低，P<0.05，見圖3。這提示，轉(zhuǎn)染后隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞抑制增殖作用有可能稍微增加。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 見圖4、5。考慮到轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有綠色熒光，本實(shí)驗(yàn)采用的TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒帶有紅色熒光，可以用于轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞凋亡檢測。檢測各組細(xì)胞凋亡率見圖5。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h，組間細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染后48 h，各組細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；轉(zhuǎn)染后72 h，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率同空白對照組細(xì)胞相比有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HniR、CmiR轉(zhuǎn)染至正常的BV-2并未導(dǎo)致明顯地凋亡誘導(dǎo)作用，因而可以用于后續(xù)研究。

3 討論

miR-98作為miRNA的一種, 研究表明其在腫瘤形成過程中發(fā)揮作用。Sukata等[4]研究發(fā)現(xiàn), miR-98與大鼠肝癌形成過程有關(guān)。另有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-98在許多腫瘤中表達(dá)失調(diào),如Yan等[5]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌中hsa-miR-98上調(diào)。有研究提出幾種可能的miR-98靶基因，如Du等[6]在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-98可下調(diào)抑癌基因FUS1的表達(dá)。小膠質(zhì)細(xì)胞是顱內(nèi)腫瘤，特別是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要組成部分，研究miR-98對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，有助于理解小膠質(zhì)細(xì)胞對腦內(nèi)微環(huán)境變化應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，并由此發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤的可能治療靶點(diǎn)。

為探討miR-98對小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的影響，我們利用構(gòu)建的pre-hsa-miR98質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞系，初步研究了其轉(zhuǎn)染率和抑制細(xì)胞增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，pre-hsa-miR-98質(zhì)粒能成功地轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染后調(diào)控miR-98表達(dá)。如前所述，miR-98在一些腫瘤中表達(dá)，并能抑制許多種腫瘤細(xì)胞的增殖和生長[3]?？紤]到本研究如果在轉(zhuǎn)染后miR-98表達(dá)抑制BV-2細(xì)胞的增殖和生長，可能會(huì)影響后續(xù)的研究，我們觀察了pre-hsa-miR-98質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞后對細(xì)胞增殖和生長的影響。研究證實(shí)，pre-hsa-miR-98質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BV-2細(xì)胞未明顯地抑制其增殖和生長，可用于后續(xù)研究。

文獻(xiàn)報(bào)道，miR-98表達(dá)可以抑制許多腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[7]。為了保證本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們檢測了BV-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，mir-98轉(zhuǎn)染并未明顯誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞凋亡。我們推測，可能因?yàn)楸狙芯坎捎玫氖钦＜?xì)胞系，而正常細(xì)胞中的相關(guān)癌基因未被激活或者抑癌基因正常發(fā)揮作用，因而未明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果值得繼續(xù)研究，以深入了解miR-98的作用。另外，本研究采用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，有效地避免了質(zhì)粒中綠色熒光的干擾，提高了檢測結(jié)果的可靠性和敏感性。

最近有報(bào)道，miR-98可以減輕心臟缺血-再灌注導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]。在缺血-再灌注中風(fēng)鼠模型，miR-98通過保護(hù)血腦屏障降低內(nèi)皮功能異常，改進(jìn)神經(jīng)病學(xué)結(jié)果[9]。這些文獻(xiàn)報(bào)道為我們進(jìn)一步研究miR-98在小膠質(zhì)細(xì)胞中的作用，提供了依據(jù)。

本研究為深入研究小膠質(zhì)細(xì)胞功能及其在腦卒中和阿爾茨海默癥等發(fā)病及進(jìn)展中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。