楊小四 蘇會萍 楊元元 胡華麟 蔣鶴飛

安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部 安徽 安慶 246052

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，廣泛存在于食品飲料包裝、粘合劑及紙張涂料中[1]。目前，研究提示，BPA對人體免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、胚胎發(fā)育等都存在不利影響，尤其是生殖系統(tǒng)[2]。BPA影響機體的作用機制復(fù)雜多樣， BPA可引起睪丸生精小管內(nèi)生精細胞、支持細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致細胞凋亡。錳超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，MnSOD)定位于線粒體，可抑制細胞內(nèi)氧化能量和自由基產(chǎn)生的場所，為抗氧化損傷重要作用[3]；去乙?；?sirtuins, SIRTs)家族中的SIRT3是線粒體中去乙酰化酶，可以調(diào)節(jié)線粒體抗氧化應(yīng)激作用[4]。BPA對雄性子鼠睪丸組織的生殖毒性是否與氧自由基清除劑MnSOD和SIRT3參與有關(guān)目前尚不明確。該研究擬采用 HE染色、電鏡觀察孕鼠染毒后對雄性子鼠睪丸生殖細胞的結(jié)構(gòu)改變，Hoechst染色顯示細胞凋亡及Western blot測睪丸組織MnSOD、SIRT3蛋白表達，為進一步探討B(tài)PA對生殖系統(tǒng)的毒理作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 BPA(美國Sigma公司，純度>99.9%)；兔抗鼠多克隆抗體MnSOD、SIRT3、GAPDH(美國Santa Cruz有限公司)；Hoechst 33258染色試劑盒、羊抗兔免疫組化二抗試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜、Super Singal化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)；實驗所需其他試劑均為分析純。80i生物顯微攝像和分析系統(tǒng)(日本Nikon 公司)；日本JEM-1230型透射電子顯微鏡等。

1.2 實驗動物 8～10周齡成年ICR小鼠90只，購于安徽省實驗動物中心(皖動準(zhǔn)字2017-01號)，其中雌鼠60只，雄鼠30只，體質(zhì)量為(28.5±2.2)g。飼養(yǎng)條件為：室內(nèi)恒溫為(22±2)℃，采取日光燈照明維持晝夜節(jié)律，每天12 h光照/12 h黑暗，自由攝食和飲水，每周更換3次墊料。本研究動物處理遵循安徽省實驗動物管理和使用規(guī)范。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與給藥 ICR小鼠在實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，于實驗前晚上以雌鼠∶雄鼠為2∶1合籠，次日檢查ICR雌鼠陰栓，顯微鏡下查陰道涂片確定有精子的記為妊娠第0天(PGD0)。隨機將受孕后的ICR雌鼠分為4組，參考本研究組前期實驗結(jié)果[5]溶劑對照組、BPA低劑量組(飲水?dāng)z入10 nmol/L BPA)、中劑量組(飲水?dāng)z入50 nmol/L BPA)、高劑量組(飲水?dāng)z入300 nmol/L BPA),染毒。雄性仔鼠產(chǎn)后6周(PGD42)處死，無菌取雄性ICR仔鼠睪丸組織，進行形態(tài)學(xué)檢查，部分睪丸組織無菌環(huán)境下放置液氮凍存?zhèn)錅y。

1.3.2 HE染色和電鏡觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)改變 HE染色睪丸標(biāo)本制備，取睪丸組織，用10%福爾馬林溶液固定, 常規(guī)脫水制片， HE染色，Nikon顯微攝像系統(tǒng)病理學(xué)觀察；電鏡標(biāo)本制備，將新鮮組織固定于2%戊二醛溶液中，進行超薄切片，枸櫞酸鉛染色，JEM-1230型透射電鏡觀察并攝片。

1.3.3 Hoechst 33258染色觀察雄性仔鼠睪丸組織細胞凋亡情況 取新鮮雄性ICR仔鼠睪丸組織，10%福爾馬林溶液固定。常規(guī)石蠟包埋，德國Leica公司RM2135型切片機厚3 μm切片，常規(guī)脫臘后，PBS緩沖液清洗3次×5 min/次，吸水紙吸盡殘存液體。每塊切片加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色10 min。PBS緩沖液清洗3次×5 min/次。將切片加上抗淬滅封片液，置于載玻片上，日本Nikon熒光顯微鏡觀察并攝片記錄。

1.3.4 Western blot檢測雄性仔鼠睪丸組織中MnSOD、SIRT3蛋白表達情況 取出液氮中前期凍存的睪丸組織，照試劑盒操作步驟進行，檢測蛋白濃度，在細胞中添加水浴鍋內(nèi)進行煮沸變性10 min，定量，-80℃保存?zhèn)溆?。配膠，每孔30 μg蛋白上樣量，按照二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法總蛋白抽提試劑盒說明書，配置細胞裂解液，勻漿、離心(速度3000 r/min，15 min)蛋白定量后，30 μg蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，250 mA恒流條件下，將蛋白濕性轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(PVDF)膜上，室溫下封閉60min；加入兔抗鼠MnSOD多克隆抗體(1∶1 500)、SIRT3多克隆抗體(1∶2 000)一抗，4 ℃冰箱孵育過夜。次日，Tris緩沖液(TBST)洗膜5 min×3次后，加入羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37℃孵育30 min。顯色采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光法，以GAPDH為內(nèi)參照，Image J軟件分析灰度值作半定量分析，實驗重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 雄性仔鼠睪丸的組織病理學(xué)改變 孕期母鼠飲水染毒的雄性仔鼠睪丸組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)經(jīng)常規(guī)HE染色顯示，溶劑對照組的睪丸組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常改變，生精小管內(nèi)可見多層生精細胞層，基底部的精原細胞排列規(guī)則，從基底面向腔面可見排列正常各級生精細胞和精子，生精小管周圍可見嗜酸性的睪丸間質(zhì)細胞，表明仔鼠已發(fā)育為成年。而BPA染毒后，生精小管內(nèi)生精細胞排列紊亂，細胞數(shù)量和層數(shù)較對照組明顯減少，尤其是BPA中劑量組、高劑量組，睪丸組織中生精細胞形態(tài)損傷嚴重，細胞排列松散，僅在基膜附近有少量生精細胞，見圖1，表明BPA對睪丸組織的損傷具有劑量依賴性，隨著BPA劑量的增加損傷加重。

2.2 雄性仔鼠睪丸的生精細胞結(jié)構(gòu)變化 溶劑對照組仔鼠生精細胞內(nèi)細胞器未見明顯異常；低劑量孕鼠染毒BPA組仔鼠睪丸內(nèi)生精細胞線粒體邊界模糊，細胞器腫脹，隨著孕鼠染毒BPA劑量的升高，中劑量組、高劑量組仔鼠睪丸內(nèi)生精細胞病理學(xué)改變明顯，胞線粒體嵴消失，呈明顯空泡樣改變，見圖2。

2.3 Hoechst染色觀察雄性仔鼠睪丸的生精細胞凋亡改變 溶劑對照組仔鼠各級生精細胞、間質(zhì)細胞和支持細胞的核呈較為均勻的藍色；孕鼠染毒BPA后，低劑量組、中劑量組仔鼠精原細胞和間質(zhì)細胞的核出現(xiàn)明顯固縮，呈致密濃染；高劑量組仔鼠精原細胞和間質(zhì)細胞的核發(fā)生固縮更為明顯，見圖3。

2.4 雄仔鼠睪丸組織中MnSOD、SIRT3蛋白的表達 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，MnSOD蛋白、SIRT3蛋白在溶劑對照組仔鼠睪丸組織中呈高表達，孕期母鼠染毒BPA后，仔鼠睪丸組織中MnSOD蛋白、SIRT3蛋白在低劑量組、中劑量組、高劑量組間表達呈下降趨勢；采用Image J軟件，進行灰度比值半定量分析，結(jié)果表明，與溶劑對照組相比，母鼠染毒BPA后，各劑量組仔鼠睪丸組織中MnSOD/GAPDH、SIRT3/GAPDH表達降低，P<0.05或0.01)。

3 討論

環(huán)境類雌激素BPA廣泛存在于日常生活中，諸如塑料制品和脂類添加劑中。研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的BPA 即對機體生殖系統(tǒng)[6]、內(nèi)分泌系統(tǒng)[7]、免疫系統(tǒng)[8]、胚胎發(fā)育[9]等方面具有長期的毒性作用。本動物實驗研究顯示，出生前母鼠染毒BPA，成年雄性仔鼠睪丸組織呈現(xiàn)明顯病理形態(tài)學(xué)學(xué)改變，表現(xiàn)為生精小管層數(shù)的減少，高劑量染毒組，成年仔鼠睪丸組織中中生精細胞數(shù)量明顯減少，由對照組的4～5層幾乎演變?yōu)閱螌樱砻?，孕期過量染毒BPA對子代生殖系統(tǒng)有較大的影響。這可能與目前由于塑料制品的廣泛使用，導(dǎo)致臨床上男性不孕癥呈上升趨勢。BPA可通過雄性小鼠睪丸中的血睪屏障，導(dǎo)致小鼠生精小管中的生精細胞失去支持細胞的緊密連接，使得支持細胞對生精小管中的各級生精細胞的支持、營養(yǎng)作用下降，導(dǎo)致生精細胞的數(shù)量降低，干擾了精子的正常生長發(fā)育[10]。同時，本實驗觀察到，染毒BPA組仔鼠生殖細胞中線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，尤其在中、高劑量組，生精細胞的分化、成熟需要充足能量，而生殖細胞中線粒體的腫脹損傷，表現(xiàn)為線粒體嵴消失，呈空泡樣改變，必然會影響其能量合成，從而影響生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞的數(shù)量和功能。Hoechst染色也顯示，母鼠染毒BPA后，仔鼠睪丸組織中生精細胞、間質(zhì)細胞和支持細胞出現(xiàn)程度不等的凋亡，主要表現(xiàn)為精原細胞和間質(zhì)細胞核發(fā)生固縮。

氧自由基清除劑MnSOD位于線粒體中，為機體一種抗氧化酶，可以催化超氧陰離子歧化反應(yīng)，降低細胞中ROS 的過度增加，維持機體組織細胞的氧化還原平衡，清除活性氧的損害。反之，當(dāng)細胞中MnSOD表達減少，組織細胞中線粒體內(nèi) ROS 升高， ROS 過量增加可損傷細胞DNA 結(jié)構(gòu)，改變細胞周期，影響細胞增殖[11]。SIRT3 為真核生物體內(nèi)具有高度保守性的去乙酰化酶，可以調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)組蛋白/非組蛋白的去乙?；瑥亩{(diào)節(jié)組織細胞的能量代謝，增加機體清除氧自由基能力[12]。而且，SIRT3可以導(dǎo)致MnSOD 122位賴氨酸殘基脫乙?；?，對MnSOD具有活化功能，從而降低機體線粒體產(chǎn)生ROS，有效防止 ROS 的蓄積[13]。本研究采用Western blot檢測，結(jié)果表明，孕鼠BPA染毒不同劑量BPA后，與對照組比較，染毒的子鼠睪丸組織MnSOD、SIRT3蛋白表達呈降低趨勢，且隨著孕鼠染毒BPA濃度的增加，仔鼠MnSOD、SIRT3表達呈降低趨勢。

綜上所述，孕鼠進行BPA染毒，可導(dǎo)致子代雄性小鼠生精細胞、支持細胞和間質(zhì)細胞的凋亡，數(shù)量減少，線粒體損傷，這種損傷的機制可能與小鼠睪丸組織細胞MnSOD、SIRT3蛋白表達降低有關(guān)。