劉慧麗 闕文忠 林燕燕 林澤燕 徐文鑫

1 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系/轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 福建 漳州 363000;2 福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 福建 南平 353000；3 漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系 福建 漳州 363000;

多發(fā)性骨髓瘤迄今仍是一種無法治愈的血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。它具有很強(qiáng)的侵襲性生長能力，瘤細(xì)胞通?？梢郧址傅饺砉趋馈ｋm然許多藥物例如硼替佐米、沙利度胺的使用，配合自體干細(xì)胞移植等手段大大改善了其預(yù)后，但最終無法避免復(fù)發(fā)和耐藥等問題[2-4]。因此，仍迫切需要尋找新的治療藥物。

植物總黃酮具有抗氧化、抗腫瘤等多種活性，尤其在抗腫瘤的開發(fā)中有潛在的價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道其在肺癌、宮頸癌、肝癌等實(shí)體瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)均有誘導(dǎo)凋亡的作用[5-8]，但對血液系統(tǒng)的腫瘤研究未見報(bào)道。本課題組從白鳳菜(Gynura formosana Kitam)中提取了白鳳菜總黃酮(total flavonoids of Gynura formosana Kitam，TFG)，旨在體外觀察TGF對多發(fā)性骨髓瘤U266細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，為將來TFG用于骨髓瘤的治療研究奠定理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 U226細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)留存?zhèn)鞔?；RPMI 1640培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清購于美國Sigma公司;MTT細(xì)胞凋亡試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒、線粒體膜電位、細(xì)胞周期檢測試劑盒、0.22 μm的濾膜均購自上海碧云天公司; 熒光顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司; 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司; 倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 TFG的制備 白鳳菜乙醇提取液轉(zhuǎn)入大孔樹脂柱，用70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇洗脫,將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，獲得TFG浸膏，所得浸膏用雙蒸水溶解,將溶解液依次經(jīng)0.45和0.22 μm的濾膜過濾,最終獲得TFG樣液，根據(jù)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法使樣液顯色,測定吸光度[9]，計(jì)算樣液中的TFG含量為2.76 mg/mL。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將U266接種于含有10 %胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中, 37℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每1～2天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞存活率檢測 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔接種于96孔板，設(shè)4個(gè)重復(fù)孔，各組加TFG至終質(zhì)量濃度分別為0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24和48 h。每孔加入10 μL MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan溶解液，適當(dāng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育。直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)formazan全部溶解，在570 nm測定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。96孔板上無細(xì)胞只有營養(yǎng)液和MTT反應(yīng)試劑的孔為空白組，有U266細(xì)胞而未添加TFG的孔為陰性對照組.計(jì)算細(xì)胞存活率和抑制率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)-A空白)/(A對照-A空白)100%；抑制率=1-細(xì)胞存活率。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集細(xì)胞,以5×105個(gè)/孔接種于6孔板，孵育過夜后，設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組TFG終濃度為0、25、50和100 μg/mL,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，隨后在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并拍照。

1.4.3 線粒體膜電位檢測 U266細(xì)胞用TFG終濃度為0、25、50和100 μg/mL作用24 h后，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。重懸細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入188 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入2 μL Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育20～30 min，孵育過程中重懸細(xì)胞2～3次，隨后置于冰浴20 min，1 000 g離心5 min，收集細(xì)胞，用100 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測。

1.4.4 細(xì)胞凋亡檢測 取處于對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，以10×104個(gè)/mL接種3 mL于6孔板，培養(yǎng)箱中孵育過夜.各組分別用0、25、50和100 μg/mL的TFG作用于細(xì)胞48 h后各自收集培養(yǎng)體系內(nèi)全部細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI染色液，輕輕混勻。室溫25℃避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，隨后流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.5 細(xì)胞周期檢測 取處于對數(shù)生長期的U266細(xì)胞，以5×104個(gè)/ mL接種3 mL于6孔板，培養(yǎng)箱中孵育過夜。各組分別用0、25、50和100 μg/mL的TFG作用于細(xì)胞24 h后各自收集培養(yǎng)體系內(nèi)全部細(xì)胞，用PBS洗滌2次, 1 000 g離心5 min，棄去PBS。用-20℃預(yù)冷的70%乙醇重懸，于4℃靜置1 h，1000 g離心5 min，收集沉淀，用PBS洗滌2次，并用500 μL PBS重懸。加入5 mL PI(10 mg /mL)染液和2.5 μl RNaseA(20 mg /mL)，避光、室溫孵育30 min。300目尼龍篩過濾細(xì)胞，進(jìn)樣于流式細(xì)胞儀檢測計(jì)算G0/G1、S、G2/M期所占百分比。

2 結(jié)果

2.1 TFG對骨髓瘤U266細(xì)胞體外增殖的影響 TFG對骨髓瘤U266細(xì)胞的體外增殖有明顯的抑制作用。與對照組相比，12.5、25、50和100 μg/mL的TFG作用不同時(shí)間后，骨髓瘤U266細(xì)胞存活率逐漸降低，P<0.05，可見抑制作用呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴效應(yīng)，見圖1。

2.2 TFG對骨髓瘤U266細(xì)胞形態(tài)的影響 隨著TFG藥物濃度的增大，U266細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)皺縮、邊緣粗糙、胞體縮小、胞體折光度減小和內(nèi)含物減少，見圖2。

2.3 細(xì)胞熒光凋亡檢測 對照組中細(xì)胞核排列比實(shí)驗(yàn)組緊密，核染色質(zhì)分布均勻，發(fā)出紅色熒光，未見綠色凋亡熒光細(xì)胞；25 μg/mL TFG實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞排列緊密，發(fā)出紅色熒光，較對照組可見散在綠色凋亡熒光細(xì)胞；50 μg/mL TFG實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞數(shù)量減少，較多細(xì)胞出現(xiàn)明亮綠色熒光細(xì)胞，表明部分細(xì)胞的細(xì)胞膜受損；100 μg/mL TFG實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞胞體腫脹，發(fā)生染色質(zhì)凝集和細(xì)胞膜破損，較多細(xì)胞核發(fā)出明亮綠色熒光，見圖3。

2.4 TFG對U266細(xì)胞凋亡的影響 處理24 h后，與對照組相比，隨著TGF濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例逐漸增加，P<0.05，見圖4。

2.5 TFG對U266細(xì)胞周期分布的影響 處理24 h后，與對照組相比，隨著藥物濃度的增加，S期的細(xì)胞百分比明顯增多，P<0.05；而G2/M期的細(xì)胞百分比逐漸下降，P<0.05，見圖5。

而本研究結(jié)果顯示TGF作用U266細(xì)胞24及48 h的IC50分別為46.6和10.45 μg/mL，藥效更為顯著。在線粒體膜電位熒光凋亡檢測中也顯示，隨著TGF的濃度增高，在藥物作用下，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細(xì)胞表面即細(xì)胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細(xì)胞外部，與帶有綠色熒光的FITC標(biāo)記的AnnexinV染色，結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡與藥物作用的濃度正相關(guān)，流式細(xì)胞儀凋亡檢測也顯示隨著藥物溶度的增加，凋亡增加明顯，100 μg/mL凋亡細(xì)胞增加明顯占97%。細(xì)胞周期檢測表明TGF可影響U266細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞周期阻滯于S期。

3 討論

自然來源的營養(yǎng)素能有效消除癌癥細(xì)胞，探索天然、高效和低毒的藥物進(jìn)行長期的輔助抗癌具有重要意義。白鳳菜中的豐富的黃酮成分，有學(xué)者體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)改成能有效抑制肺癌、食管癌、宮頸癌等實(shí)體瘤細(xì)胞株。在本課題組前期研究中已被證實(shí)對肝癌HepG2細(xì)胞亦有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用[10]，TGF作用24及48 h的IC50分別為190.80和125.96 μg/mL。

綜上所述，一定劑量的TFG可抑制U266細(xì)胞活性并誘導(dǎo)其凋亡，可能同細(xì)胞周期的捕獲和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)，待進(jìn)一步研究作用機(jī)制及動物實(shí)驗(yàn)后，可為研究和開發(fā)TFG 作為抗多發(fā)性骨髓瘤的天然藥物提供了理論基礎(chǔ)。