程玥 李劍怡 饒盼盼 劉華芬 王晞

光遺傳學(xué)是一種新興技術(shù),對過表達光敏蛋白的細(xì)胞進行光學(xué)干預(yù)實施可逆、低創(chuàng)地調(diào)節(jié)細(xì)胞的電活動[1]。Nussinovitch等[2]用藍(lán)光脈沖激活表達在心臟的陽離子通道視紫紅質(zhì)-2(Ch R2)而直接起搏心臟。Bruegmann等[3]離體灌流Ch R2轉(zhuǎn)基因小鼠心臟并予以心外膜光照,成功終止了誘發(fā)的室性心律失常。光遺傳學(xué)通過持續(xù)的光照使表達Ch R2的心肌細(xì)胞進行選擇性、均勻和持續(xù)的去極化,使其成為一種有前景的無痛終止的方法。筆者利用載有ChR2目的基因的9型腺相關(guān)病毒(AAV9),通過靜脈注射的方式,實現(xiàn)Ch R2在SD 大鼠心臟的表達并經(jīng)光起搏驗證,進而構(gòu)建基于急性心肌梗死(簡稱心梗)的室性心律失常病理模型,驗證了光遺傳學(xué)終止心室顫動(簡稱室顫)或室性心動過速(簡稱室速)的有效性,并探討了不同功率密度的光照對于終止效率的影響,及多脈沖光照模式對終止的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康SPF級SD 大鼠的幼鼠18只,由華中科技大學(xué)實驗動物中心提供,于武漢第三實驗動物中心SPF屏障內(nèi)繁殖飼養(yǎng)。

將實驗動物隨機分成3組:ChR2光照組6只,ChR2未光照組6只,空載病毒組6只,經(jīng)頸靜脈[4]給前兩組動物注射100μl含Ch R2 的病毒載體p AAV-CAG-hCh R2(H134R)-mCherry,空載病毒組注射100μl空載病毒p AAV-CAG-mCherry。腺相關(guān)病毒購自武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 起搏閾值評價

于心梗造模前進行起搏閾值測定,首先設(shè)置473 nm 的藍(lán)光激光器的脈沖頻率為8 Hz,脈沖寬度為20 ms,功率密度為2.102 mw/mm2,以連續(xù)20個脈沖照射右心室游離壁,根據(jù)同步記錄的光輸出信號與體表心電圖判斷心臟節(jié)律是否被光脈沖奪獲:對能夠被光照奪獲的大鼠,固定光照頻率8 Hz,脈沖寬度20 ms,改變光照功率密度(0.03～2.102 mw/mm2),獲得光照100%奪獲心臟所需的最小功率密度(光起搏功率密度閾值)[5]。根據(jù)獲得的光起搏功率密度閾值,計算出2、4、8、10和20倍閾值的功率密度。

1.3 心梗模型制備

所有動物均在20～25℃的SPF 級環(huán)境內(nèi)恒溫飼養(yǎng),靜脈注射操作8 周后,給大鼠腹腔注射60 mg/kg的3% 戊巴比妥鈉進行麻醉,將其仰臥位固定于手術(shù)臺上。行氣管插管術(shù),連接小動物呼吸機,正壓通氣,潮氣量10～15 ml,呼吸頻率70 次/分。開胸后用擴胸器固定,充分暴露其右心室游離壁的同時避免損傷肺葉。在肺動脈圓錐左緣與左心耳根部交界處下2 mm 處用6/0線結(jié)扎冠狀動脈左前降支,以即刻心尖表面顏色變白和心電圖第Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高判定心梗造模成功。

1.4 誘發(fā)室顫或室速及光照終止

冠狀動脈結(jié)扎30 min后,將電極置于梗死周邊區(qū),給予Burst刺激(10 V,50 Hz,100個脈沖,持續(xù)2 s)直至誘發(fā)室顫或室速。當(dāng)誘發(fā)室顫或室速持續(xù)3 s后,Ch R2光照組給予4個間隔1 s的脈沖寬度為1 s,功率密度依次分別為2、4、8、10和20倍閾值的程控光照,每只大鼠誘發(fā)成功的室顫或室速為50次,按功率密度2→4→8→10→20倍閾值的順序進行終止,每只大鼠每種功率密度為10次室顫或室速終止；Ch R2未光照組(n＝6),每只大鼠誘發(fā)成功的室顫或室速為50次,不給予光照干預(yù)。對空載病毒組心臟,當(dāng)室顫或室速誘發(fā)持續(xù)3 s后,給與4個間隔1 s的光刺激(脈沖寬度為1 s,功率密度為9.8 mw/mm2即20倍的閾值均值),每只大鼠誘發(fā)成功的室顫或室速為50次。終止成功的標(biāo)準(zhǔn)為光照結(jié)束后1 s或室顫或室速發(fā)生后11 s內(nèi),心電圖由室顫或室速波形恢復(fù)成竇性心律。終止率＝終止次數(shù)/誘發(fā)次數(shù)×100%,各組終止率為該組大鼠單只終止率的均數(shù)。N 為大鼠只數(shù),n1為總誘發(fā)次數(shù),n2為終止次數(shù)。光輸出信號與體表心電圖均由Intensity Lab 生理記錄儀(AD Instrument)同步記錄,以Labchart8.0軟件進行分析。

1.5 HE染色和mCherry熒光觀察

實驗結(jié)束后,三組大鼠均剪取心臟,生理鹽水沖洗干凈,4%多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋切片。第一張切片用蘇木素和伊紅染液進行HE 染色,觀察心肌的形態(tài)學(xué)變化。第二張制備熒光切片,用倒置熒光顯微鏡觀察mCherry的紅色熒光,以確定病毒的轉(zhuǎn)染情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 光終止效率研究

2.1.1 有效性評價 20個8 Hz、20 ms的藍(lán)光脈沖照射右心室,在一定功率范圍內(nèi)能夠奪獲ChR2組心臟的節(jié)律,光照脈沖信號與心電圖QRS波呈1∶1關(guān)系(圖1),但不能奪獲空載病毒組的節(jié)律(圖2),所需最小光照功率密度為(0.49±0.11)mw/mm2。ChR2光照組終止率為98.0%±2.0%(N＝5,n1＝50,n2＝49。1只大鼠由于呼吸機故障,未完成終止過程,僅計入20倍閾值功率下的終止效率),明顯高于ChR2未光照組51.7%±6.0%(N ＝6,n1＝300,n2＝155)(P＜0.0001)和空載病毒組57.2%±6.8%(N＝6,n1＝300,n2＝172)(P＜0.0001),后兩組的終止率無明顯的差別(P＝0.7649),三組終止情況比較見圖3。

圖1 藍(lán)光(20個波長473 nm、頻率8 Hz、脈寬20 ms、功率密度為0.49 mw/mm2 的脈沖)光照Ch R2組SD 大鼠心臟右室完全1∶1起搏心臟的心電圖

圖2 藍(lán)光(20個波長473 nm、頻率8 Hz、脈寬20 ms、功率密度為2.102 mw/mm2 的脈沖)光照空載病毒組SD 大鼠心臟右室不能奪獲心臟節(jié)律

圖3 三組終止情況對比

2.1.2 不同功率密度的光照對于終止效率的影響 當(dāng)室顫或室速誘發(fā)成功持續(xù)3 s后,于右室外膜給予4個間隔1 s脈沖寬度為1 s的程控光照,功率密度依次增加至2、4、8、10、20倍功率密度閾值,結(jié)果顯示終止率隨之增加(P＝0.0054),依次為64.0%±6.8%、70.0%±7.1%、74.0%±8.7%、88.0%±3.7%和98.0%±2.0%,且均高于ChR2未光照組51.7%±6.0%和空載病毒組57.2%±6.8%的終止率。分析ChR2光照組大鼠每次室速或室顫的終止結(jié)果,大鼠隨著光功率密度和脈沖數(shù)量的增加,光終止效率亦升高,20倍閾值、4個脈沖終止效率最高(表1)。

2.2 HE染色

三組大鼠之間HE 染色無明顯區(qū)別,各組內(nèi)均為左室梗死區(qū)心肌纖維排列紊亂,細(xì)胞橫紋消失,碎片溶解,大量炎癥細(xì)胞浸潤,心肌纖維呈波浪狀,或肌漿凝聚形成強嗜酸性紅染,崩碎成粗顆?；虺蓤F塊；右室非梗死區(qū)心肌纖維排列規(guī)則,細(xì)胞膜完整,無炎癥細(xì)胞浸潤(圖4)。

表1 ChR2光照組大鼠的不同光脈沖數(shù)下不同光功率密度的終止效率/%

圖4 三組大鼠心臟HE染色病理圖比較(標(biāo)尺:50μm)

2.3 mCherry的熒光表達

Ch R2光照組和Ch R2未光照組的左室、室間隔和右室的熒光切片顯示出均勻分布的mCherry紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,表示腺相關(guān)病毒AAV9轉(zhuǎn)染目標(biāo)光敏感蛋白Ch R2成功,且在全心均有較為一致的表達(圖5)?？蛰d病毒組的熒光切片顯示出均勻分布的mCherry紅色熒光標(biāo)記,由于不能被光照奪獲節(jié)律,表示腺相關(guān)病毒AAV9轉(zhuǎn)染成功但未表達光敏感蛋白Ch R2。

3 討論

光敏感蛋白Ch R2來自萊茵衣藻,是本研究的重要光學(xué)工具蛋白,由737個氨基酸組成的7次跨膜的非選擇性陽離子通道蛋白,由通道蛋白-2(Chop-2)與視黃醛結(jié)合形成,屬于視蛋白的一種,藍(lán)光光照使ChR2分子構(gòu)象發(fā)生變化形成非選擇性陽離子通道,對一價陽離子Na＋、K＋、H＋等和二價陽離子Ca2＋等具有通透性,使細(xì)胞膜電位變?yōu)閮?nèi)正外負(fù),引起細(xì)胞去極化興奮,進而改變細(xì)胞的膜電勢產(chǎn)生感應(yīng)電流[6]。Ch R2在400～500 nm 波長范圍內(nèi)的藍(lán)光照射下可被激活,通道打開,在470 nm 處具有最大活化峰,在470 nm 的藍(lán)光照射下,當(dāng)光子流密度為2.2×1015/(cm2·s－1)的光強時大多數(shù)細(xì)胞可檢測到電流[7]。Ch R2是光遺傳學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的興奮性光敏蛋白之一,本研究也基于Ch R2的光學(xué)特性利用載有Ch R2目的基因的p AAVCAG-hCh R2(H134R)-mCherry,通過頸靜脈注射的方式,完成光敏感蛋白Ch R2 在SD 大鼠心臟的全心表達,同時通過mCherry的紅色熒光特性驗證ChR2的表達。

圖5 三組大鼠心室不同部位的mCherry紅色熒光圖(標(biāo)尺:50μm)

光遺傳技術(shù)充分結(jié)合了遺傳學(xué)與光學(xué)的優(yōu)勢,即基因編輯技術(shù)的靶向精確性,光敏通道電流微秒級的瞬變性,光投射的非接觸準(zhǔn)直定向性,光束聚焦與彌散的操控靈活性等[8]。因此在治療心律失常方面有很大的潛力,可以借助基因編輯和修飾技術(shù)將光敏蛋白高效穩(wěn)定地表達于心臟的靶細(xì)胞和靶部位；或不同類型的光敏感蛋白組合可形成興奮、抑制或雙向調(diào)控,基于超極化機制[9－11]或去極化[2,12－13]機制治療心律失常。Nyns等[14]通過短陣快速電刺激誘發(fā)大鼠離體心臟的室性心動過速,470 nm 的藍(lán)光光刺激成功終止97%的單形性室速和57%的多形性室速。本研究中驗證了光遺傳學(xué)終止室顫或室速的有效性,Ch R2光照組的終止率遠(yuǎn)高于其他兩組；同時,隨功率密度增加和脈沖數(shù)增加,終止率隨之增加,多脈沖光照模式對終止有積極的影響。目前所研究的光遺傳學(xué)終止室顫或室速大多基于去極化終止,有兩種可能的機制:①光遺傳學(xué)奪獲填補興奮性間隙,但需要心臟表面整體照明或通過心外膜電圖標(biāo)測出興奮間期后再觸發(fā)局部照明；②通過連續(xù)的光遺傳學(xué)去極化產(chǎn)生透壁傳導(dǎo)阻滯,這種機制需要更多的光能,且需要針對特定的解剖區(qū)域如心梗邊界區(qū)或緩慢傳導(dǎo)區(qū)域[15－16]。本研究中高終止率需要高功率密度(即高光能)的光照,最有可能的終止機制應(yīng)該為連續(xù)的光遺傳學(xué)去極化產(chǎn)生透壁傳導(dǎo)阻滯,所產(chǎn)生的電阻滯區(qū)打斷先前存在的折返環(huán)路終止室性心律失常。