安廣杰 靳 穎 張培旗 胡金強(qiáng) 趙學(xué)偉 劉 洋 王章存

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001)

大豆是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物，不僅是食用油的重要來源，也可為食品工業(yè)提供大量的蛋白質(zhì)[1]。而且大豆蛋白質(zhì)的氨基酸比例合理，與FAO/WHO 的推薦模式相近，有利于人體的消化與吸收。另外，大豆蛋白具有一定的乳化性、發(fā)泡性等，在食品加工中應(yīng)用有利于改善食品的感官品質(zhì)[2，3]。

然而，大豆又是國際公認(rèn)的八大致敏食物之一。大豆蛋白在機(jī)體內(nèi)可以引起一種由特異性IgE介導(dǎo)的，由細(xì)胞免疫和體液免疫共同作用的混合型的過敏反應(yīng)[4]，其癥狀表現(xiàn)為腹瀉、皮疹、蕁麻疹，嚴(yán)重的伴有顫抖、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀。目前，世界范圍內(nèi)13%的兒童和0.5%的成人都對大豆有不同程度的過敏癥狀，嚴(yán)重影響了大豆的食用價(jià)值。大豆蛋白的致敏性對人體生長發(fā)育的不良影響成為全世界廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[5]。

大豆發(fā)芽是一種常見的加工方式，豆芽也是人們喜愛的傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)食品。大豆發(fā)芽過程中發(fā)生一系列的代謝活動，產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，也有利于促進(jìn)人體對大豆?fàn)I養(yǎng)成分的消化與吸收，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值[6]。目前關(guān)于大豆發(fā)芽過程中營養(yǎng)成分的變化報(bào)道較多[7，8]。但涉及發(fā)芽中大豆抗原蛋白分子成分和抗原活性及其變化規(guī)律的報(bào)道極少。此次研究了不同發(fā)芽過程中的抗原蛋白的分子成分、主要抗原蛋白的抗原活性以及氨基酸、異黃酮、抗壞血酸等營養(yǎng)成分的變化，為開發(fā)低致敏性的大豆發(fā)芽產(chǎn)品提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

市售非轉(zhuǎn)基因大豆、大豆β-伴球蛋白ELISA 試劑盒、大豆球蛋白ELISA試劑盒、低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)，2,6-二氯靛酚、純抗壞血酸、染料木素。

1.2 主要儀器

LRH-系列生化培養(yǎng)箱，F(xiàn)D-1-50型冷凍干燥機(jī)，JSM-7001F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，DYY-6C型電泳儀，835型氨基酸分析儀，iMark酶標(biāo)儀，UV-8100 B紫外可見分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽大豆制備[9]

選取外觀良好、籽粒飽滿、大小均勻的大豆，將其分為七份，每份80粒，稱重并記錄數(shù)據(jù)。用蒸餾水沖洗數(shù)次后，將其浸泡于1.5%的次氯酸鈉溶液中漂洗3次，浸泡在蒸餾水中12 h后，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，每隔12 h澆一次水，每24 h取樣一次，至第7 d結(jié)束。將取出的樣品置于-20 ℃冷凍干燥、稱重后保存。并分別與未發(fā)芽大豆干物質(zhì)作對比計(jì)算干物質(zhì)損失率(%)。

1.3.2 發(fā)芽不同時(shí)期大豆樣品的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化

將冷凍干燥后的樣品粉碎、過200目篩、分裝貼標(biāo)，對上述樣品進(jìn)行噴金鍍膜處理，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)進(jìn)行觀察。

1.3.3 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

將發(fā)芽和未發(fā)芽大豆的干燥物粉碎過200目篩，用Tris-Cl緩沖液(pH8.0)提取蛋白[10]。采用Laemml方法做SDS-PAGE電泳分析[11]。濃縮膠和分離膠濃度分別為5%和12%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色后觀察譜帶變化。

1.3.4 大豆樣品抗原活性的測定

稱取不同樣品粉末各50 mg，用Tris-Cl緩沖液(pH8.0)緩沖液提取蛋白。分別采用競爭法7Sβ-伴球蛋白和11S大豆球蛋白ELISA試劑盒檢測抗原活性。具體操作步驟按照ELISA試劑盒說明書。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD 值)，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中抗原蛋白濃度。每個(gè)樣品測定重復(fù)三次，以發(fā)芽樣品測定結(jié)果與未發(fā)芽大豆結(jié)果的比值表示抗原活性剩余率/%，考查發(fā)芽過程中的抗原活性變化。數(shù)據(jù)采用ORIGIN 8.0軟件處理。

1.3.5 氨基酸含量的測定

按照GB 5009.124—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定。主要步驟為：稱取粉末樣品各50 mg，用6 mol/L鹽酸于110 ℃水解24 h，用氨基酸分析儀測定，色譜柱為磺酸型陽離子樹脂，衍生劑為茚三酮，檢測波長570 nm和440 nm。

1.3.6 抗壞血酸含量測定

以2,6-二氯酚靛酚滴定法測定[12]。用2%的草酸溶液提取，以0.1 mg/mL的純抗壞血酸溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。每份樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆在發(fā)芽過程中干物質(zhì)含量的變化

大豆種子萌發(fā)過程中將進(jìn)行一系列新陳代謝活動。發(fā)芽前期，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪的降解[13]。圖1顯示，大豆在發(fā)芽過程中干物質(zhì)損失率不斷增加，即干物質(zhì)含量不斷減少，至發(fā)芽7 d時(shí)干物質(zhì)損失24.6%。盡管發(fā)芽過程不斷有新的蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)的合成，但在避光培養(yǎng)時(shí)，由于不能進(jìn)行光合作用，大豆干物質(zhì)一致呈現(xiàn)減少的趨勢。

圖1 大豆在發(fā)芽過程中干物質(zhì)含量變化

2.2 大豆在發(fā)芽過程中組織結(jié)構(gòu)的變化

大豆吸水和發(fā)芽過程中，其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。圖2是利用場發(fā)射電子顯微鏡對樣品表面超微形貌觀察結(jié)果?？梢钥闯觯S著發(fā)芽時(shí)間的增加大豆子葉的孔徑逐漸變大、結(jié)構(gòu)變得越來越疏松。蛋白體逐漸融合形成大液泡, 原質(zhì)體出現(xiàn)稀疏的片層結(jié)構(gòu)。這與文獻(xiàn)通過電鏡觀察的現(xiàn)象吻合[14]。文獻(xiàn)中通過電鏡觀察到大豆隨發(fā)芽時(shí)間的增加其子葉細(xì)胞內(nèi)含物不斷被消解；發(fā)芽第6天的大豆中有些蛋白體內(nèi)只存有稀薄的絮狀蛋白質(zhì)，蛋白體膜清晰可見，甚至有的蛋白體基質(zhì)已消失殆盡[14]。

圖2 大豆在發(fā)芽過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

這種結(jié)構(gòu)有利于各種酶的活化和釋放，進(jìn)一步促進(jìn)各種代謝活動，包括抗原蛋白的降解、豆芽生長需要的各種成分的合成等[15]。大豆中主要的蛋白是7S和11S儲存蛋白，也是抗原活性較高的抗原蛋白。由此可以推斷，大豆在發(fā)芽過程中抗原性可能會因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的降解而降低。

2.3 大豆在發(fā)芽過程中蛋白質(zhì)成分的變化

為了分析發(fā)芽過程中大豆蛋白的降解情況，本文將發(fā)芽不同時(shí)間樣品做的SDS-PAGE，結(jié)果如圖3所示，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長，大豆蛋白質(zhì)的分子量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，分子量較大的蛋白質(zhì)逐漸減少，小分子蛋白逐漸增加。在發(fā)芽3 d時(shí)(泳道3)，大豆β-伴球蛋白的α′-和α-亞基顏色明顯變?nèi)酰l(fā)芽5 d時(shí)，兩個(gè)亞基幾乎完全消失。相對而言，β-亞基降解較慢，發(fā)芽前3 d內(nèi)譜帶顏色幾乎沒有變化，發(fā)芽5 d時(shí)才明顯變?nèi)??？赡苁怯捎讦聛喕噍^于α′和α亞基的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不容易受到外界影響，因此不易發(fā)生降解[16，17]；在體外用商品蛋白酶制劑水解大豆蛋白時(shí)也出現(xiàn)了相似的規(guī)律[18]。

注：M：Marker；0:原始大豆；1:發(fā)芽1 d；2:發(fā)芽2 d；3:發(fā)芽3 d；4:發(fā)芽4 d；5:發(fā)芽5 d；6:發(fā)芽6 d 7:發(fā)芽7 d。

大豆11S球蛋白的酸性鏈在發(fā)芽到第4 d后迅速降解，發(fā)芽至5 d時(shí)，幾乎看不到酸性肽鏈的存在，而堿性鏈在發(fā)芽6 d時(shí)譜帶顏色仍然較深，降解不明顯。這可能是與大豆球蛋白的晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)，酸性肽鏈比堿性肽鏈更容易發(fā)生水解，故酸性肽鏈消失的比較快[19]。

另外，大豆發(fā)芽3 d時(shí)，還產(chǎn)生了分子量范圍大致為23～30 ku的4條新譜帶，圖中所示d、e、f 3個(gè)譜帶顏色較深)，這些譜帶是伴隨著β-伴球蛋白的α′-和α-亞基的譜帶減弱而出現(xiàn)的，推測它們可能是α′-和α-亞基降解后的產(chǎn)物。而且其后隨著11S球蛋白酸性肽鏈譜帶降解和發(fā)芽時(shí)間延長，這幾條新生成的譜帶顏色還有加深的趨勢。有可能酸性肽鏈的降解后也形成了這些分子量相近的小肽。發(fā)芽過程中抗原蛋白分子的降解也意味中大豆抗原活性的降低。

Wilson等[20]曾報(bào)道了大豆發(fā)芽過程中和蛋白質(zhì)亞基的變化，與本實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜有相似之處，但Wilson所用大豆實(shí)驗(yàn)材料中有比11S的堿性肽鏈更小的組分(14、17 ku)存在。可能與本研究的大豆品種有差異。

2.4 大豆發(fā)芽過程中的抗原活性變化

大豆發(fā)芽過程中，蛋白質(zhì)分子發(fā)生不同程度的降解。為了探討其抗原活性變化，本研究分別采用專用ELISA試劑盒分別測定不同發(fā)芽時(shí)間7S β-伴球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性。

由圖4a可知：隨著發(fā)芽時(shí)間的增加，大豆中7S β-伴" />球蛋白和大豆11S球蛋白的抗原活性均出現(xiàn)降低現(xiàn)象，但二者變化幅度和趨勢不同。在發(fā)芽的前4天中，β-伴球蛋白的活性剩余58%(即降低42%)，其后降低幅度較小，至發(fā)芽7 d時(shí)抗原性仍然達(dá)到52%。11S球蛋白的抗原活性變化較平穩(wěn)，且變化幅度小于β-伴球蛋白，發(fā)芽7 d時(shí)抗原活性還有69%。

圖4 大豆在發(fā)芽過程中其抗原性的變化

2.5 大豆在發(fā)芽過程中氨基酸含量變化

大豆具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，其中一個(gè)原因就是由于其含有多種人體必需的氨基酸且組分合理，故對不同時(shí)期豆芽樣品的氨基酸含量進(jìn)行了測定與分析，以研究發(fā)芽處理對大豆的營養(yǎng)特性的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，大豆發(fā)芽過程中天冬氨酸的含量顯著增加，谷氨酸的含量明顯降低，其他氨基酸的含量沒有明顯變化，此結(jié)果與等研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致，說明大豆在發(fā)芽過程中天冬氨酸和谷氨酸參與的代謝活動旺盛[21，22]。

表1 大豆不同發(fā)芽階段的氨基酸總量 / (%，干基計(jì))

2.6 發(fā)芽大豆中抗壞血酸含量的變化

抗壞血酸即維生素C對人體健康具有重要作用。干燥的大豆種子中總抗壞血酸含量極少，而發(fā)芽會使抗壞血酸含量增加[23]。為探究度發(fā)芽時(shí)期抗壞血酸的變化規(guī)律，對發(fā)芽不同時(shí)期豆芽的抗壞血酸含量測定結(jié)果如圖5所示。

圖5 大豆發(fā)芽過程中抗壞血酸含量變化

由圖5可以看出，發(fā)芽過程中大豆抗壞血酸含量呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在第3 d達(dá)到最大值，與文獻(xiàn)中的結(jié)果相似[24]。據(jù)報(bào)道，發(fā)芽前期，大豆中半乳糖酸內(nèi)酯脫氫酶活性較高，而此酶與抗壞血酸的合成密切相關(guān)[25]。但在發(fā)芽4 d后，參與合成抗壞血酸的酶基因表達(dá)水平降低[26]，從而導(dǎo)致抗壞血酸量減少。

3 結(jié)論

大豆發(fā)芽過程中，其組織結(jié)構(gòu)形態(tài)、蛋白質(zhì)分子成分、抗原活性和部分營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生率規(guī)律性變化。子葉組織結(jié)構(gòu)變得疏松，干物質(zhì)含量逐步減少，大豆中的主要儲藏蛋白7S β-伴球蛋白的α′和α亞基和11S球蛋白的酸性鏈降解較快，而β-伴球蛋白的β-亞基和11S球蛋白的堿性肽鏈降解較慢。β-伴球蛋白和11S球蛋白的抗原活性在發(fā)芽前4 d中降低較快，后期變化不同明顯。氨基酸總量變化不大，但谷氨酸增加和天冬氨酸降低幅度較大?？箟难岷肯仍黾雍蠼档?。所以，在食用發(fā)芽大豆時(shí)仍然要注意食品安全性。