覃喬靜 常凱利 孟利霞 董 楠 趙仲華 劉學(xué)光，3△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科 上海 200240；2復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032；3上海市腎臟疾病與血液凈化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200032）

足細(xì)胞構(gòu)成腎小球?yàn)V過膜最外一層，其胞質(zhì)向外突起形成足突。足細(xì)胞的多種特異性細(xì)胞骨架蛋白（包括synaptopodin、nephrin 等）在其受損后表達(dá)降低，足突消失甚至從基膜脫落，是導(dǎo)致腎小球硬化及蛋白尿的最常見原因［1-2］。腎上腺髓質(zhì)肽（adrenomedullin，AM）是一種小分子擴(kuò)血管肽，體內(nèi)分布廣泛，且發(fā)揮一定的腎臟保護(hù)作用［3-5］。在受損足細(xì)胞中，AM 蛋白及其核酸表達(dá)均顯著增強(qiáng)［6-7］。Rho GTPases 家族在調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白起關(guān) 鍵作 用，主要 成 員 包括RhoA、Rac1 和Cdc42［8］。我們在前期研究中證實(shí)，AM 不僅通過上調(diào)Rho GTPases 活性促進(jìn)足細(xì)胞細(xì)胞間接觸的形成［9］，且可顯著升高RhoA 活性、增強(qiáng)RhoA-synaptopodin 相互作用，促進(jìn)由嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside，PAN）所誘導(dǎo)受損足細(xì)胞的修復(fù)［10］。然而，有關(guān)Rac1 及Cdc42 在AM 保護(hù)足細(xì)胞中的作用尚不明確。因此，我們擬用PAN 處理造成大鼠足細(xì)胞損傷，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)及建立大鼠PAN 腎病模型，并應(yīng)用AM 蛋白進(jìn)行干預(yù)，以觀察足細(xì)胞特異性細(xì)胞骨架蛋白以及Rac1/Cdc42 的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討AM 發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制。

材料和方法

細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)分組永生化小鼠足細(xì)胞株按本團(tuán)隊(duì)前述方法［9］進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞株在33 ℃、添加γ-干擾素條件下呈增殖狀態(tài)，在37 ℃、無干擾素條件下進(jìn)行分化。在33 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中以γ-干擾素（10 U/mL）、10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，亞融合狀態(tài)時(shí)按1∶10 比例傳代，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱分化10～14 天。將分化成熟的足細(xì)胞以無血清培養(yǎng)液靜止12 h 后分為4 組：正常對照組（control）、PAN 處理組（100 μg /mL，美國Sigma 公司）、PAN 聯(lián)合AM（10-7mol/L，蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司）處理組、PAN 聯(lián)合AM 及PKA抑制劑H89（10-6mol/L，美國Sigma 公司）處理組，分別處理24 h 后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)（Rac1、cdc42 以及足細(xì)胞、骨架蛋白synaptopodin、nephrin）的檢測。

大鼠PAN 腎病模型健康雄性SD 大鼠購自上海SLAC 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，清潔級，體質(zhì)量130～150 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和進(jìn)水，普通光照。隨機(jī)分為3 組：（1）PAN 損傷組（PAN 組），一次性腹腔注射PAN（150 mg/kg 體質(zhì)量）；（2）AM 治療組（AM+PAN 組），每天經(jīng)尾靜脈注射AM（66 μg/kg 體重）直至相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)處死；（3）對照組，以無菌生理鹽水代替藥物。在首次注射PAN 后第3、7、14 天，分別以代謝籠收集大鼠24 h 尿液，隨后處死大鼠，留取腎組織。部分腎皮質(zhì)經(jīng)剪碎、過濾不同孔徑篩網(wǎng)，分離并收集腎小球；部分腎皮質(zhì)凍存于-70 ℃，用于提取組織蛋白。

尿蛋白SDS-PAGE 電泳收集24 h 尿液，10 000×g4 ℃離心5 min，取上清行SDS-PAGE 電泳，將膠行考馬斯亮藍(lán)染色，反復(fù)換液脫色后拍照，應(yīng)用圖像分析軟件對條帶進(jìn)行吸光度分析。

透射電鏡觀察腎皮質(zhì)組織切至1 mm3大小，經(jīng)2.5%戊二醛、1%四氧化鋨雙重固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂812 包埋，超薄切片經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡（日立H-7000，日本日立公司）觀察并拍照，應(yīng)用FEI Tecnai G2 Spirit 透射電鏡（美國FEI 公司）及FEI Tecnai 4.3 成像軟件，對每只大鼠至少10 個(gè)毛細(xì)血管袢的足突寬度進(jìn)行測量分析。

免疫熒光染色體外培養(yǎng)足細(xì)胞以4%多聚甲醛固定，3%BSA 封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，以Alexa Fluor 488/546 標(biāo)記的熒光二抗（1∶200，美國Invitrogen 公司）37 ℃孵育1 h，DAPI 襯染細(xì)胞核，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡（TCS-SP8，德國Leica 公司）觀察拍照。所用一抗包括：兔抗synaptopodin（1∶50）和羊抗desmin（1：50，美國Santa Cruz 公司）。

采用OpalTM4 色熒光免疫組化試劑盒（美國Perkin Elmer 公司）對腎組織石蠟切片行AMsynaptopodin 和synaptopodin-desmin 雙重免疫熒光染色。該試劑盒應(yīng)用酪胺信號放大技術(shù)（tyramide signal amplification，TSATM）。石蠟切片常規(guī)脫蠟，3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，封閉液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，第一重一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記二抗孵育10 min，TSA 染色孵育10 min；微波處理去除第一重一抗及二抗，封閉液封閉，加第二重一抗，方法同上。DAPI 襯染細(xì)胞核，甘油封片，應(yīng)用Vectra 多光譜成像系統(tǒng)（美國Caliper 公司）進(jìn)行圖片掃描。所用一抗包括：兔抗AM、羊抗synaptopodin、羊抗desmin（1∶2 500，美國Santa Cruz 公司）。

Western blot以含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取足細(xì)胞或腎組織總蛋白，以BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，經(jīng)SDS-PAGE 電泳并濕轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂牛奶封閉2 h 后，一抗4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記二抗（1∶1 000，上海優(yōu)寧維試劑公司）常溫孵育2 h。經(jīng)曝光、顯影、成像，應(yīng)用圖像分析軟件對特異性條帶進(jìn)行吸光度分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3 次。所用一抗包括：小鼠抗Cdc42、兔抗Rac1、兔抗synaptopodin、羊抗desmin（1∶500，美國Santa Cruz 公司）。

實(shí) 時(shí) 定 量RT-PCR（qRT-PCR）Trizol（美 國Invitrogen 公司）法提取足細(xì)胞RNA，測定其濃度，使用mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primescrip RT Master Mix，日本Takara 公司）將目的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq?試劑盒（日本Takara 公司）行qRT-PCR，反應(yīng)條件為95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，擴(kuò) 增40 個(gè) 循 環(huán)。選 擇GAPDH 為 內(nèi) 參 照 基 因，采 用2-ΔΔCT法 進(jìn) 行 半 定 量分析。

谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶-拉下實(shí)驗(yàn)檢測Rho GTPases 活性采用Rho GTPases 活化分析組合生化試劑盒（美國Cytoskeleton 公司）特異性檢測處于活性狀態(tài)的Rho GTPases，按照操作說明進(jìn)行［11］。將體外培養(yǎng)的足細(xì)胞或分離的腎小球以含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，隨后與PAK-PBD 瓊脂糖珠孵育，清洗后加入SDS 上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min，按前述Western blot 法進(jìn)行檢測。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間采用獨(dú)立樣本配對t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AM 對體外培養(yǎng)足細(xì)胞特異性骨架蛋白表達(dá)的影響雙重免疫熒光染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin 及其受損標(biāo)志物desmin 的表達(dá)結(jié)果顯示，在正常足細(xì)胞中，synaptopodin 染色為位于胞質(zhì)及細(xì)胞膜的排列有序的絲狀或線狀結(jié)構(gòu)，desmin 染色為陰性或胞質(zhì)內(nèi)極微弱染色；經(jīng)PAN 作用后，synaptopodin 染色顯著減弱且呈現(xiàn)為排列紊亂的絲狀結(jié)構(gòu)，而desmin 染色顯著增強(qiáng)；AM 蛋白顯著抑制PAN 所介導(dǎo)的效應(yīng)，該表達(dá)趨勢可被PKA 抑制劑H89 阻斷（圖1A）。Western blot 結(jié)果顯示，與對照組比較，PAN 顯著抑制synaptopodin、nephrin 表 達(dá) 而 升高desmin 蛋 白 水平，該作用被AM 顯著抑制，H89 顯著阻斷AM 所介導(dǎo)的效應(yīng)（圖1B）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，PAN 顯著抑制synaptopodin 及nephrin 的mRNA 表達(dá)，該作用可被AM 顯著抑制，H89 顯著阻斷AM 的作用（圖1C）。

AM 對體外培養(yǎng)足細(xì)胞Rac1/Cdc42 表達(dá)的影響與對照組相比，PAN 顯著下調(diào)Rac1 及Cdc42 的總蛋白水平及活性，該作用被AM 顯著阻斷，AM 所介導(dǎo)的效應(yīng)被H89 顯著阻斷（圖2）。

AM 對大鼠尿蛋白水平的影響SDS-PAGE結(jié)果顯示，PAN 組3 天時(shí)尿蛋白水平即顯著升高，7天、14 天尿蛋白水平進(jìn)一步升高，且主要成分為白蛋白（圖3A）；與模型組相比，PAN+AM 組在3 個(gè)時(shí)相點(diǎn)的尿蛋白水平均顯著低于模型組（圖3B）。

AM 對大鼠足突寬度的影響經(jīng)電鏡觀察，PAN 組3 天即出現(xiàn)足細(xì)胞廣泛腫脹、足突顯著變寬；7 天及14 天時(shí)，足突廣泛消失伴大量微絨毛形成，與尿蛋白水平趨勢一致。與PAN 組相比，AM+PAN 組足突寬度顯著降低（圖4）。

大鼠腎小球AM 的表達(dá)synaptopodin-AM 雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，AM 主要定位于足細(xì)胞；與對照組比較，PAN 組足細(xì)胞AM 表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖5）。

大鼠足細(xì)胞特異性骨架蛋白的表達(dá)synaptopodin-desmin 雙重免疫熒光雙染色結(jié)果顯示：與對照組相比，PAN 組synaptopodin 在各時(shí)相點(diǎn)逐漸下降，而desmin 表達(dá)逐漸增強(qiáng)；與PAN 組相比，PAN+AM 組synaptopodin 明 顯 增強(qiáng)而desmin 顯著降低（圖6A）。Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，PAN 組synaptopodin 及nephrin 的蛋白表達(dá)水平顯著下降，經(jīng)AM 干預(yù)后則顯著升高（圖6B）。

AM 對大鼠分離腎小球Rac1/Cdc42 表達(dá)的影響由大鼠腎皮質(zhì)組織分離腎小球（圖7A）。與對照組相比，PAN 組Rac1、Cdc42 蛋白表達(dá)及活性均顯著下降，經(jīng)AM 干預(yù)后則顯著升高，但仍低于對照組（圖7B、7C）。

討 論

Rho GTPases 屬于Ras 超家族，相對分子質(zhì)量（Mr）為20 000～30 000，是一類GTP 結(jié)合蛋白，當(dāng)其與GTP 相結(jié)合時(shí)為活性狀態(tài)，與GDP 相結(jié)合時(shí)為非活性狀態(tài)，從而發(fā)揮“分子開關(guān)”的作用，調(diào)控其下游多種效應(yīng)分子的活化［8］。Rho GTPases 在調(diào)控足細(xì)胞形態(tài)及功能中發(fā)揮重要作用，而不同Rho GTPases 成員可能發(fā)揮不同調(diào)控作用。對足細(xì)胞條件性Rho GTPases 敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，僅Cdc42（而非RhoA 或Rac1）敲除小鼠表現(xiàn)為先天性腎病綜合征、足突消失及腎小球硬化，出生后2 周即因腎功能衰竭而死亡［11-12］。Cdc42 在由高糖、脂多糖及ADR 所致受損足細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平及活性均呈顯著下降；應(yīng)用siRNA 技術(shù)或特異性抑制劑靶向下調(diào)Cdc42 表達(dá)，無論在體內(nèi)或體外均可導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡及蛋白尿的產(chǎn)生［13］。提示，在生理?xiàng)l件下Cdc42 在維持足細(xì)胞正常形態(tài)和功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。相對比而言，足細(xì)胞條件性Rac1 敲除小鼠雖然不發(fā)生腎功能障礙且足細(xì)胞發(fā)育正常，但其在以魚精蛋白硫酸鹽灌注造成的急性足細(xì)胞損傷［11］或STZ 誘導(dǎo)的糖尿病腎?。?4］中，足細(xì)胞損傷及蛋白尿均得到顯著緩解，該作用與Rac1/PAK1/p38/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被特異性抑制密切相關(guān)［14］。然而，在慢性高血壓性腎小球損傷［11］或由阿霉素誘導(dǎo)的FSGS 模型［15］中，足細(xì)胞條件性Rac1 敲除小鼠表現(xiàn)為更嚴(yán)重的足細(xì)胞丟失、蛋白尿及腎小球硬化，且與mTOR 通路被抑制顯著相關(guān)［15］。此外，足細(xì)胞特異性Rac1 敲入通過活化的P38MAPK-β1-整合素信號通路導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失甚至脫失以及大量蛋白尿的產(chǎn)生［16-17］，腎組織形態(tài)由早期MCD 進(jìn)展為FSGS［16］。在人MCD 及FSGS 腎活檢標(biāo)本中，足細(xì)胞Rac1 活性顯著升高［16］。抑制Rac1 可發(fā)揮一定程度的足細(xì)胞保護(hù)作用。在腎5/6 切除所致慢性腎損傷模型中，應(yīng)用Rac1 抑制劑可顯著減輕蛋白尿水平及腎組織損傷形態(tài)學(xué)［18］。激素治療可通過抑制Rac1 表達(dá)發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用［19］。上述研究提示，Rac1 在不同類型的足細(xì)胞損傷中介導(dǎo)不同的效應(yīng)。

最近，Wan 等［20］在轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞Rac1 活性的升高程度與其對足細(xì)胞損害程度呈劑量依賴性，中等程度Rac1 活性升高并不損害腎小球?yàn)V過屏障，但加重甲硝唑會導(dǎo)致足細(xì)胞損傷；當(dāng)Rac1 活性顯著升高時(shí)，nephrin 及podocin 表達(dá)顯著下降，導(dǎo)致大量蛋白尿、足突消失，斑馬魚發(fā)生水腫、乃至幼年期即死亡。此外，Muraleedharan 等［21］在果蠅腎細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，Rac1 及Cdc42 之間的平衡表達(dá)在維持足細(xì)胞細(xì)胞骨架穩(wěn)定表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。Stephenson 等認(rèn)為對Rho GTPases 的研究不應(yīng)僅限于其定量表達(dá)，更應(yīng)結(jié)合其空間表達(dá)來揭示其作用機(jī)制［22］。因此，在不同損傷因素所致復(fù)雜的腎小球內(nèi)環(huán)境中，對Rac1 及Cdc42 時(shí)空表達(dá)的深入研究將有助于闡明其作用機(jī)制。

PAN 是一種來源于鏈霉菌屬細(xì)菌的氨基核苷類抗生素，是通過造成足細(xì)胞毒性損傷而建立腎病綜合征動(dòng)物模型的常用藥物之一［23］。在大鼠PAN腎病模型的修復(fù)期，足細(xì)胞Rac1 表達(dá)開始升高，提示其與促進(jìn)足突修復(fù)有關(guān)；體外研究表明，Rac1 活性在發(fā)生分化的足細(xì)胞中明顯升高，表達(dá)增強(qiáng)的Rac1 可顯著促進(jìn)未分化足細(xì)胞的偽足（足突）形成［24］。過表達(dá)nephrin 不僅通過激活磷酸肌醇-3-激酶信號通路升高Rac1 活性［25］，且通過激活cAMP反應(yīng)元件連接蛋白（cAMP response elementbinding protein，CREB）促進(jìn)synaptopodin 表達(dá)升高與集聚［26］，對大鼠PAN 腎病模型發(fā)揮保護(hù)作用。上述研究提示，Rho GTPases 與細(xì)胞骨架蛋白之間相互作用在調(diào)控足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能中的重要作用。本研究分別經(jīng)體外足細(xì)胞培養(yǎng)并成功建立大鼠PAN 腎病模型，發(fā)現(xiàn)AM 顯著改善由PAN 所致足細(xì)胞特異性骨架蛋白synaptopodin 和nephrin 的表達(dá)下降、損傷特異性標(biāo)志物desmin 的表達(dá)增強(qiáng)、大鼠尿蛋白水平以及足突廣泛消失，提示AM 對PAN 所致足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。此外，AM 在體內(nèi)、外均顯著拮抗由PAN 所致Rac1 和Cdc42 蛋白水平及活性的下降，提示AM 可通過上調(diào)Rac1 和Cdc42 蛋白表達(dá)及活性，穩(wěn)定細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用。

cAMP 作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，主要通過激活PKA 發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞骨架形成的 功 能。Azeloglu 等［27］分 離 大 鼠PAN 腎 病 模 型 的腎小球并應(yīng)用蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)活化的cAMPPKA 通過激活其下游轉(zhuǎn)錄因子CREB 從而增強(qiáng)synaptopodin 的表達(dá)，促使腎組織形態(tài)和功能的恢復(fù)。應(yīng)用腺苷酸環(huán)化酶激動(dòng)劑forskolin［28-29］或內(nèi)源性cAMP 激 活 劑—異 丙 腎 上 腺 素［30］，或 選 擇 性cAMP/PKA 激活劑（pCPT-cAMP），均可減輕阿霉素腎病小鼠蛋白尿水平和足細(xì)胞足突消失，緩解由ADR 或PAN 所致足細(xì)胞損傷及丟失，促使synaptopodin，nephrin 等表達(dá)。以上研究提示，cAMP-PKA 信號通路是維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究中，AM 對PAN 的拮抗作用可被PKA 抑制劑H89 所阻斷，提示AM 主要通過PKA 信號通路調(diào)控Rac1/Cdc42 進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)。此外，我們在大鼠PAN 腎病模型中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞AM 的表達(dá)在3 天時(shí)即顯著增強(qiáng)，且隨時(shí)相點(diǎn)其表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示AM 在足細(xì)胞遭受損傷后的反饋性保護(hù)機(jī)制，且可能參與足細(xì)胞損傷后修復(fù)。

綜上所述，AM 可能主要通過活化PKA 信號通路，穩(wěn)定細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)，從而在體內(nèi)、外對由PAN 所致足細(xì)胞損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用，該作用與AM 上調(diào)Rac1 及Cdc42 蛋白表達(dá)及活性密切相關(guān)。進(jìn)一步深入探討調(diào)控Rho GTPases 活化狀態(tài)的蛋白分子，Rho GTPases 不同成員之間的串話（cross talk），以及Rho GTPases 活性變化時(shí)的時(shí)點(diǎn)、部位，將有助于揭示AM 對Rho GTPases 及足細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白的調(diào)控機(jī)制，為臨床治療以足細(xì)胞損傷為主的腎臟疾病提供更多的理論依據(jù)及作用靶點(diǎn)。