秦懿偲 周德健 李超群 余 巍

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物系 上海 200438）

賴氨酸乙酰化修飾是一種保守的、可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與調(diào)控許多細(xì)胞信號通路和疾病發(fā)病過程。乙?；揎椡ㄟ^改變賴氨酸殘基上的電荷導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，進(jìn)而影響酶活、定位、DNA結(jié)合力和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性［1-2］。蛋白質(zhì)的賴氨酸乙酰化由賴氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶（lysine acetyltransferases，KATs）和賴氨酸去乙?；福╨ysine deacetylases，KDACs）調(diào) 控。Sirtuins 家族是第Ⅲ類KDACs，它們的去乙?；钚砸蕾囉贜AD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）。SIRT2 作為Sirtuins 家族的成員之一，參與多種病理生理的發(fā)展過程，包括衰老［3］、能量限制［4-5］、細(xì) 胞 凋 亡［6］和 炎 癥 反 應(yīng)［7］等。研 究 顯 示SIRT2 與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［8］。

氨酰tRNA 合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，AARS）是一個與蛋白質(zhì)翻譯緊密相關(guān)的古老的蛋白質(zhì)家族，由20 種酶組成。這些酶通過識別對應(yīng)氨基酸，使其與消耗ATP 的特定tRNA 連接起來，合成氨酰-tRNA，進(jìn)而為最終蛋白質(zhì)合成提供底物。且作為管家蛋白質(zhì)，AARS 在漫長的進(jìn)化過程中相當(dāng)保守。近年來研究揭示了AARSs 在調(diào)控細(xì)胞生理活動時的新功能。例如，酪氨酰tRNA 合成酶可以作為白藜蘆醇的靶點(diǎn)，在應(yīng)激條件下，由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，影響DNA 損傷修復(fù)［9-10］；谷氨酰胺tRNA 合成酶可以同凋亡信號調(diào)節(jié)激酶ASK1 相互作用，進(jìn)而對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響［11］。在斑馬魚的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，絲氨酰tRNA 合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRS）可以通過調(diào)控血管生成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子——血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表達(dá)，進(jìn)而在封閉血液循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮重要作用［12-14］。

研究表明，SerRS 可與SIRT2 相互作用，招募SIRT2 入核，且SerRS 與SIRT2 的相互 作用會 增強(qiáng)SIRT2 的去乙?；钚裕?5］。但是，SerRS 與SIRT2作用的具體機(jī)制仍不清楚。本研究驗(yàn)證了SerRS能夠與SIRT2 相互作用，并且增強(qiáng)其作用于底物α-微管蛋白（α-tubulin）的去乙?；富钚?。通過對SIRT2 的H187 位 點(diǎn) 的 探 究，檢 測 其 對SIRT2 與SerRS 結(jié)合的調(diào)控作用，同時通過結(jié)構(gòu)模擬進(jìn)行分析，為靶向SIRT2 的H187 位點(diǎn)治療心血管疾病提供了新的方向和思路。

材料和方法

材料和試劑HEK293T 細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室，DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司，SeryltRNA synthetase、SIRT2 和HA 抗 體 購 自 英 國Abcam 公司，α-微管蛋白及其K40Ac 抗體分別購自美國Invitrogen 公司和美國Proteintech 公司，F(xiàn)LAG和MYC 抗體則分別購于美國Sigma 公司和美國Cell Signaling Technology 公 司，F(xiàn)lag 磁 珠 購 自 德 國Sigma Aldrich 公司。KOD-plus 定點(diǎn)突變試劑盒購自日本東洋紡公司，煙酰胺購自美國Sigma 公司，BL21 感受態(tài)菌株購自上海擎科生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小抽試劑盒購自天根生物科技公司。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要采用PEI試劑（以10 cm 培養(yǎng)皿為例）。在添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293T 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時，即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1 mL DMEM 培養(yǎng)基、5 μg 目的質(zhì)粒及15 μL PEI 試劑依次加入1.5 mL EP 管中，反復(fù)吹打混勻，室溫靜置20 min。將EP 管內(nèi)的混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖勻，放入37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后更換培養(yǎng)基，24～36 h 后回收細(xì)胞。

免疫共沉淀以10 cm 培養(yǎng)皿為例，除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用4 ℃PBS 溶液洗滌3 次，加入預(yù)冷的1 mL 裂解液（提前加入蛋白酶抑制劑），將培養(yǎng)皿置于4 ℃水平搖床上，快速裂解20 min。結(jié)束后充分吹打，將裂解液收集到1.5 mL EP 管中，4 ℃下12 000×g離心30 min。取上清，轉(zhuǎn)移到新的EP 管中。取64 μL 上清，加入16 μL 5×SDS 上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min，用作細(xì)胞裂解樣品（Input）。剩余上清中 加 入10 μL Flag 磁 珠，4 ℃旋 轉(zhuǎn)3 h 或 過 夜。4 ℃下2 000×g離心2 min，去上清。加入1 mL 裂解液，混勻，4 ℃下2 000×g離心2 min，重復(fù)3 次。加入70 μL 1×SDS 上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min，行Western blot 檢測。

Western blot 檢測向電解槽中加入適量電泳緩沖液后上樣，80 V 恒壓跑30 min，電壓調(diào)至130 V跑1～1.5 h，樣品前沿跑至最底端即可轉(zhuǎn)膜，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)60 min。用5% BSA 溶液（M/V）室溫封閉1 h。一抗孵育，4 ℃搖床過夜或室溫?fù)u床1 h。1×TBST 溶液洗膜5 min，重復(fù)3 次。加入HRP 標(biāo)記的抗小鼠或抗兔的二抗，室溫孵育1 h。1×TBST 溶液洗膜3 次，進(jìn)行顯影記錄。

蛋白質(zhì)純化將目的片段克隆重組到pET28ahis 載體上，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21。挑取成功表達(dá)質(zhì)粒的單菌落到含有3～5 mL LB（含抗生素）的搖菌管中，37 ℃下培養(yǎng)至菌液渾濁，轉(zhuǎn)移到含有1 L LB（含抗生素）的錐形瓶中進(jìn)行擴(kuò)增，37 ℃下培養(yǎng) 至D600為0.6～0.8，加 入 終 濃 度 為1 mmol/L 的IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，16 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)20 h。4 ℃下5 000×g離心20 min，收集沉淀細(xì)菌。

用緩沖液［200 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）+500 mmol/L NaCl+25 mmol/L 咪唑］重懸菌液，在4 ℃下使用流動泵將有His 標(biāo)簽的蛋白掛到提前平衡好的1 mL 鎳柱上，用AKTA 將鎳柱上的蛋白洗脫下來。濃縮分裝，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SIRT2 酶活檢測酶活反應(yīng)液配方為50 mmol/L Tris-HCl（pH=9.0）、4 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT、1 μmol/L MAL［Boc-Lys（AC）amc］和1 mmol/L NAD+。將純化的野生型SIRT2 與SerRS 按照一定的摩爾濃度比加入上述反應(yīng)液中，以MAL［Boc-Lys（AC）amc］為底物在37 ℃下進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)置0、1、2、3 h 的反應(yīng)時間梯度，加入與反應(yīng)體系體積相同的停止液（含0.05 g/mL 胰蛋白酶）停止反應(yīng)，并按照指示測量熒光強(qiáng)度（F360/F460）［16］。

結(jié) 果

SIRT2 與SerRS 在細(xì)胞內(nèi)的相互作用我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證SIRT2 與SerRS 在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。因?yàn)镾IRT1 定位于核內(nèi)，且被證明可以促進(jìn)血管生成［17］，所以我們同時驗(yàn)證了SIRT1是否可以在細(xì)胞內(nèi)與SerRS 結(jié)合。 首先在pCDNA3.1b（-）載體上構(gòu)建帶有Flag 標(biāo)簽的SerRS表達(dá)質(zhì)粒，同時構(gòu)建帶有HA 標(biāo)簽的SIRT1、SIRT2重組質(zhì) 粒，將SIRT1、SIRT2 分別 與SerRS 共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)。轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞裂解液，使用Flag M2 磁珠進(jìn)行免疫共沉淀。Western blot 結(jié)果顯示，外源Flag-SerRS 和SIRT2-HA 存在明顯的相互作用，但沒有檢測到與SIRT1-HA 的相互作用（圖1A）。通過半內(nèi)源的方法在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)lag-SIRT1 與lag-SIRT2，免疫共沉之后檢測內(nèi)源的SerRS，結(jié)果與之前相同（圖1B）。

有研究報道定位于胞質(zhì)的TyrRS 在一定條件下可入核與SIRT1 發(fā)生結(jié)合［18］。我們在293T 細(xì)胞中同時過表達(dá)外源的SIRT2-HA 和Flag-TyrRS，并沒有發(fā)現(xiàn)兩者的相互作用（圖1C）。證明并不是所有細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的SerRS 都能與SIRT2 結(jié)合。

SerRS 可增強(qiáng)SIRT2 的去乙酰化酶活性為了驗(yàn)證SerRS 與SIRT2 的相互作用對SIRT2 酶活性的影響，我們使用MAL［Boc-Lys（AC）amc］作為底物來進(jìn)行去乙?；富钚詸z測。MAL 的N-端與C-端分別與熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)偶聯(lián)，去乙酰化酶反應(yīng)前不能發(fā)出熒光。一旦SIRT2 進(jìn)行去乙?；磻?yīng)，淬滅基團(tuán)與MAL 分離，即可發(fā)出熒光，去乙?；傅幕钚钥赏ㄟ^測量相應(yīng)的熒光強(qiáng)度來檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SerRS 能顯著提升SIRT2 依賴NAD+的去乙酰化酶活性，且隨著SerRS 蛋白質(zhì)濃度的增加，其對SIRT2 酶活的促進(jìn)作用增強(qiáng)（圖2A）。

α-微管蛋白作為SIRT2 去乙?；孜镏唬湟阴；潭瓤烧{(diào)控自身的穩(wěn)定性，進(jìn)而對糖尿病性心肌病及相關(guān)心力衰竭產(chǎn)生一定的影響［19］。我們將微管蛋白作為反應(yīng)底物，煙酰胺（nicotinamide，NAM）作為SIRT2 去乙酰化反應(yīng)抑制劑，在體外按照0、1、2 的SerRS 與SIRT2 摩爾濃度比梯度與細(xì)胞裂解液在反應(yīng)液中混合，經(jīng)Western blot 驗(yàn)證，微管蛋白乙?；诫SSerRS 濃度增加而不斷降低（圖2B）。因此，SerRS 可增強(qiáng)SIRT2 酶活性，使α-微管蛋白的乙?；潭冉档汀?/p>

SIRT2 H187 位點(diǎn)可影響與SerRS 的結(jié)合為了尋找影響SIRT2 和SerRS 互作的位點(diǎn)，通過檢索文獻(xiàn)并對不同物種的SIRT2 之間的同源性進(jìn)行比對，我們發(fā)現(xiàn)SIRT2 上的H187 位點(diǎn)保守性較高（圖3A）。該位點(diǎn)對SIRT2 本身依賴NAD+的去乙?；富钚杂嘘P(guān)鍵作用［20］。當(dāng)187 位點(diǎn)組氨酸（H）突變成酪氨酸（Y）時，SIRT2 酶活喪失。我們以另一個影響SIRT2 酶活的S368D 突變?yōu)閷φ眨ㄟ^外源和半內(nèi)源的方法，檢測在細(xì)胞內(nèi)SerRS 和SIRT2 及其H187Y、S368D 突變型是否有相互作用。結(jié)果表明：SIRT2 的H187Y 突 變 型 不 再 與SerRS 相 結(jié) 合，而S368D 突變卻不影響其與SerRS 的相互作用（圖3B～3C）。

為進(jìn)一步確認(rèn)H187 位點(diǎn)突變對其與SerRS 結(jié)合的影響，我們構(gòu)建了SIRT2 H187A 突變型。當(dāng)187 位點(diǎn)H 突變成丙氨酸（A）時，會降低SIRT2 的去乙酰化酶活性［20］。我們同樣用外源的方法檢測了SIRT2 H187A 與SerRS 的相互作用，發(fā)現(xiàn)與H187Y 相比，H187A 與SerRS 的 結(jié) 合 相對較強(qiáng)，但仍弱于SIRT2 與SerRS 的相互作用（圖3D）。結(jié)果表明，SIRT2 的H187 位點(diǎn)可調(diào)控其與SerRS 的相互作用，當(dāng)H 突變?yōu)閅 時產(chǎn)生的影響最大。

SIRT2 突變位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)分析SIRT2 上與SerRS 結(jié)合的界面包含兩部分，即Gly52-Asp60 和Trp337-Ser356［15］。為了進(jìn)一步研究SIRT2 H187 位點(diǎn)對其與SerRS 結(jié)合的影響，我們嘗試從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度進(jìn)行深入探討，采用軟件對人源SIRT2（PDB ID 編號：1J8F）的H187Y 突變進(jìn)行了結(jié)構(gòu)模擬（圖4）。

與野生型相比，187 位點(diǎn)H 突變?yōu)閅 時，會與相鄰的Q267 位點(diǎn)發(fā)生空間上的沖突。一方面，酪氨酸側(cè)鏈比組氨酸的更長，所以與267 位谷氨酰胺羰基氧之間的距離從2.5? 縮短為2.3?，在空間上不合理；另一方面，突變后187 位點(diǎn)酪氨酸殘基側(cè)鏈變?yōu)樨?fù)電，且與267 位谷氨酰胺的羰基相斥。由此推測，H187Y 突變體破壞了復(fù)合結(jié)構(gòu)中同267 位Q 的相互作用，進(jìn)而影響SIRT2 的構(gòu)象，使其與SerRS 相互作用的2 個位點(diǎn)發(fā)生了距離改變，進(jìn)而影響其與SerRS 的相互作用。

SerRS 可被SIRT2 去乙酰化因?yàn)镾IRT2 能夠與SerRS 相互作用，且SIRT2 是去乙?；?，為探究SerRS 是否存在乙?；揎?，我們通過NAM 處理細(xì)胞進(jìn)行檢測。首先在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行Flag-SerRS轉(zhuǎn)染，12 h 后用5 mmol/L NAM 按照0、2、4 h 時間梯度處理，隨后裂解細(xì)胞并使用Flag 磁珠進(jìn)行免疫共沉淀。Western blot 結(jié)果顯示，SerRS 存在乙?；揎棧译S著NAM 處理時間增加，乙?；讲粩嗵岣撸▓D5A）。因此確定Sirtuins 為SerRS 的去乙?；揎椕?。

進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染Flag-SerRS 與SIRT2-HA，免疫共沉淀后經(jīng)Western blot 檢測顯示，SIRT2在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，SerRS 的乙?；潭认陆担▓D5B）。因此認(rèn)為，SIRT2 是SerRS 的去乙?；?。

討 論

乙酰化修飾在表觀遺傳及代謝調(diào)控中具有重要的作用，其調(diào)控的紊亂與許多疾病密切相關(guān)，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?1］、癌癥［22］和心血管疾?。?3］等。心血管疾病作為威脅人類健康的一大疾病，已知的發(fā)病機(jī)制涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬、細(xì)胞的凋亡與再生等，這些都被證明與SIRT2 緊密相關(guān)。

心力衰竭是許多心血管疾病常見的終末期病癥，其特征之一是心肌的病理性肥大。有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，SIRT2 敲除小鼠在注入血管緊張素Ⅱ后，心肌肥厚、纖維化加重，心臟功能受損。相反，SIRT2 過表達(dá)可防止損傷［24］。體外實(shí)驗(yàn)表明，SIRT2 過表達(dá)可保護(hù)心肌細(xì)胞在血清饑餓條件下不發(fā)生凋亡，而NAM 則可抑制SIRT2 進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡［25］。但是，SIRT2 在心血管疾病中的確切作用仍需要進(jìn)一步研究，以驗(yàn)證SIRT2 是否能像SIRT1 或SIRT3 一樣，成為心血管疾病治療或預(yù)防的靶點(diǎn)。SIRT2 抑制劑已經(jīng)在治療神經(jīng)退行性疾病中顯示出積極的意義，有研究發(fā)現(xiàn)抑制SIRT2 可在細(xì)胞水平上減少帕金森病相關(guān)毒性蛋白α-synuclein 的積累和聚集［26］。

SerRS 定位于細(xì)胞質(zhì)，屬于第二類AARS。其結(jié)構(gòu)中特有的UNE-S 結(jié)構(gòu)域中存在核定位信號（nuclear localization signal，NLS），能引導(dǎo)SerRS 入核［27］，進(jìn)而參與血管生成的調(diào)控。在心血管疾病中，血管生成對梗死后心臟和循環(huán)功能的恢復(fù)至關(guān)重要，血管生成不足會阻止缺血后的恢復(fù)，并可能導(dǎo)致心肌梗死后的心力衰竭［28］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斑馬魚體內(nèi)SIRT2 的蛋白質(zhì)表達(dá)量降低時，VEGFA 的表達(dá)量上升，血管生成增加［15］。

SerRS 可以通過招募SIRT2 入核，對VEGFA基因的組蛋白去修飾以抑制其表達(dá)。SIRT1 和SIRT2 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，且都可介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過藥物抑制SIRT2 可以降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞毒性［29］。我們通過免疫共沉淀驗(yàn)證了SerRS 能夠與SIRT2 相互作用，而不與SIRT1結(jié)合。SIRT2 通過調(diào)節(jié)α-微管蛋白的乙?；?，導(dǎo)致血管重構(gòu)，從而調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移［30］。以α-微管蛋白為底物，我們發(fā)現(xiàn)SerRS 與SIRT2 的相互作用可增強(qiáng)SIRT2 的去乙?；富钚?。由于SIRT2 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，參與調(diào)控多種生理過程，SerRS 也同樣定位于胞質(zhì)，兩者相互作用后在SerRS 的核定位信號引導(dǎo)下入核。從另一角度說明，SerRS 對SIRT2 酶活的增強(qiáng)作用可能對整體代謝水平產(chǎn)生影響，這為研究心血管疾病提供了一個新的思路。

目前對SerRS 如何在細(xì)胞核中控制VEGFA 表達(dá)已研究得較為清楚，但其中SerRS 的作用及其激活SIRT2 的機(jī)制卻并不清楚。通過數(shù)據(jù)比對，我們發(fā)現(xiàn)SIRT2 的H187 位點(diǎn)保守性較高，而該位點(diǎn)也是SIRT2 的去乙?；钚缘年P(guān)鍵位點(diǎn)。對該位點(diǎn)的深入探究顯示，H187A 突變可降低SIRT2 去乙?；富钚?，同時其與SerRS 的結(jié)合減弱。而使SIRT2 失活的H187Y 突變則阻斷了SIRT2 與SerRS 的結(jié)合。以上結(jié)果初步表明，SIRT2 的H187位點(diǎn)對其與SerRS 的結(jié)合具有重要的調(diào)控作用，尤其是SIRT2 H187Y 突變型不與SerRS 結(jié)合。根據(jù)上述結(jié)果，通過結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)，187 位點(diǎn)突變?yōu)槔野彼岷?，會與相鄰的Q267 位點(diǎn)發(fā)生空間上的沖突，可能改變SIRT2 構(gòu)象，進(jìn)而影響SIRT2 與SerRS 的結(jié)合。SerRS 在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，分析其原因，除了其氨基?；δ茉诘鞍踪|(zhì)合成中至關(guān)重要外，也存在SerRS 參與其他信號通路的調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的可能性?？梢酝ㄟ^調(diào)控SIRT2 的H187 位點(diǎn)來影響SerRS 對SIRT2 的招募及激活作用，同時不影響SerRS 本身的氨?；钚?。

由于SIRT2 為去乙?；福覀兺ㄟ^實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SerRS 存在 乙 酰 化修 飾，且SIRT2 可 調(diào)控SerRS 的乙?；?。乙?；揎椗c蛋白質(zhì)降解、核定位等功能相關(guān)，同時SerRS 招募SIRT2 入核會影響血管生成，所以SIRT2 對SerRS 乙?；揎椀恼{(diào)控很可能在該過程中發(fā)揮功能。結(jié)合上述發(fā)現(xiàn)的H187 位點(diǎn)對SIRT2 自身去乙?；富钚杂兄匾绊?，后續(xù)的工作可進(jìn)一步研究SIRT2 對SerRS 的乙?；{(diào)控機(jī)制及其在疾病和腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了SerRS 作用于SIRT2 并增強(qiáng)其酶活的潛在位點(diǎn)，拓展了對于SerRS 和SIRT2在許多相關(guān)疾病中的認(rèn)識，并為針對SIRT2 的藥物研發(fā)以及相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。