張娟 陳家斌 陳龍 彭沛 余鳳榮

糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致糖尿病及慢性腎衰竭死亡的重要原因之一，主要表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增生小管間質(zhì)擴(kuò)張，腎小球系膜區(qū)和小管間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)積聚等，最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎臟纖維化[1]。DN的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與系膜細(xì)胞損傷，在腎臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]；還參與腎小管間質(zhì)纖維化，與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[3]。缺氧誘導(dǎo)因子HIF2α在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中能增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)，而抑制miR-30c-2-3p表達(dá)可以增強(qiáng)HIF2α表達(dá)，說(shuō)明miR-30c-2-3p與腎細(xì)胞癌的進(jìn)展相關(guān)[4]。增加miR-30c-2-3p的表達(dá)可提高足細(xì)胞的活力，同時(shí)可增加Nephrin和Podocin蛋白的表達(dá)[5]。但miR-30c-2-3p對(duì)腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響還不清楚。髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員之一，也是一種炎性指標(biāo)，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，與多種疾病相關(guān)[6]。在高糖的人腎小球系膜細(xì)胞中MPO、蛋白的表達(dá)增加[7]，MPO與空腹血糖水平呈正相關(guān)，在糖尿病微血管病變機(jī)制中起著十分重要的作用，檢測(cè)MPO及空腹血糖濃度，對(duì)于糖尿病并發(fā)微血管病變的預(yù)防和治療具有重要的意義[8]。但miR-30c-2-3p是否通過(guò)MPO影響腎小球系膜細(xì)胞的進(jìn)展還不清楚，本文旨在研究miR-30c-2-3p對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響以及是否通過(guò)MPO發(fā)揮作用，為糖尿病腎病的診斷、治療和預(yù)后提供新的思路和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球系膜細(xì)胞HMC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、BCA試劑盒、PBS緩沖液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；抗體均購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RIPA蛋白裂解液、PVDF膜、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：將腎小球系膜細(xì)胞HMC在37℃、含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每天換液一次，將融和至80%左右的細(xì)胞無(wú)血清饑餓培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組，用終濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液刺激細(xì)胞作為高糖組(HG)，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，同時(shí)以終濃度為5 mmol/L的葡萄糖溶液處理細(xì)胞作為正常對(duì)照組(NG)。將miR-NC，miR-30c-2-3p、anti-miR-NC、anti-miR-30c-2-3p分別轉(zhuǎn)染至未經(jīng)任何處理的HMC細(xì)胞中，記為miR-NC組，miR-30c-2-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-30c-2-3p組。將miR-NC、miR-30c-2-3p轉(zhuǎn)染至高糖處理的HMC細(xì)胞中，記為HG+miR-NC組、HG+miR-30c-2-3p組。將miR-30c-2-3p與pcDNA3.1、pcDNA3.1-MPO分別共同轉(zhuǎn)染至高糖處理的HMC細(xì)胞中，記為HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1組、HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1-MPO組；轉(zhuǎn)染均采用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)miR-30c-2-3p的表達(dá)水平：收集各組細(xì)胞，研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA，微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度。使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，4℃，12 000 g離心15 min，收集蛋白上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。分別加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，后在暗室中曝光顯影，再浸入定影，最后洗去殘液晾干，將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)TNF-α和IL-6的表達(dá)：取各組細(xì)胞，離心取上清，然后按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-30c-2-3p對(duì)MPO的靶向調(diào)控：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示MPO 3′UTR區(qū)域有miR-30c-2-3p結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)MPO的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-MPO和MUT-MPO)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期小鼠足細(xì)胞接種于24孔板(5×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用LipofectamineTM 2000將WT-MPO和MUT-MPO組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-30c-2-3p。依據(jù)說(shuō)明書要求，使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-30c-2-3p在高糖作用的細(xì)胞HMC中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG組相比，HG組細(xì)胞HMC中miR-30c-2-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢?，miR-30c-2-3p在高糖作用的細(xì)胞HMC中低表達(dá)。見表1。

表1 miR-30c-2-3p在高糖作用的細(xì)胞HMC中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞中miR-30c-2-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)?？梢姡^(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p可抑制高糖作用的HMC細(xì)胞凋亡。見圖1，表2。

圖1 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡的影響;A 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡的影響;B 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

表2 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC中IL-6、TNF-α表達(dá)的影響 ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)?？梢?，過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p抑制高糖作用的細(xì)胞HMC中IL-6、TNF-α的表達(dá)。見表3。

表3 過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC中IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

2.4 miR-30c-2-3p靶向、調(diào)控MPO 通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到MPO與miR-30c-2-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型MPO基因表達(dá)載體WT-MPO后，相較于miR-NC組，miR-30c-2-3p組WT-MPO腎小球系膜細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染突變型MPO基因表達(dá)載體MUT-MPO后，相較于miR-NC組，miR-30c-2-3p組MUT-MPO腎小球系膜細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于miR-NC組，miR-30c-2-3p組腎小球系膜細(xì)胞中MPO蛋白的表達(dá)水平顯著降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-30c-2-3p組腎小球系膜細(xì)胞中MPO蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。可見，miR-99a-3p可靶向調(diào)控MPO的表達(dá)。見圖2，表4、5。

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 miR-30c-2-3p調(diào)控MPO的表達(dá)

圖2 miR-30c-2-3p靶向、調(diào)控MPOA：MPO的3’UTR含有miR-30c-2-3p的互補(bǔ)序列 B：miR-30c-2-3p調(diào)控MPO的表達(dá)

2.5 過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡及IL-6、TNF-α表達(dá)的影響 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax、MPO蛋白的表達(dá)水平顯著降低；與HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1組相比，HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1-MPO組HMC細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax、MPO蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞的凋亡率顯著降低；與HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1組相比，HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1-MPO組HMC細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，與HG+miR-NC組相比，HG+miR-30c-2-3p組HMC細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低；與HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1組相比，HG+miR-30c-2-3p+pcDNA3.1-MPO組HMC細(xì)胞中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)?？梢?，過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡及IL-6、TNF-α表達(dá)的抑制作用。見圖3，表6、7。

圖3 過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡蛋白表達(dá)的影響

表6 過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞HMC凋亡的影響

表7 過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-3p對(duì)高糖作用的細(xì)胞中IL-6、TNF-α表達(dá)的影響

3 討論

DN最終導(dǎo)致的終末期腎功能衰竭是糖尿病患者死亡率高的原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康，腎小球系膜細(xì)胞的異常增殖是早期DN的重要特征，研究其具體的作用機(jī)制有助于早期診斷和預(yù)防[9]。研究發(fā)現(xiàn)許多miRNAs在腎臟發(fā)育、進(jìn)展和相關(guān)疾病中扮演重要角色[10]，且在DN中異常表達(dá)，參與DN的發(fā)病機(jī)制[11]。研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-2-3p在大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型中高表達(dá)，且抑制miR-30c-2-3p可通過(guò)上調(diào)XBP1表達(dá)減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[12]。miR-30c-2-3p還通過(guò)下調(diào)乳腺癌中的TRADD和CCNE1負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期進(jìn)程[13]；有研究通過(guò)對(duì)原發(fā)性局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎患者血漿和正常人血漿進(jìn)行miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-30c-2-3p在腎炎患者中低表達(dá)[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30c-2-3p在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-30c-2-3p表達(dá)可抑制高糖作用的HMC細(xì)胞凋亡，抑制IL-6、TNF-α的表達(dá)。

MPO主要是由中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一種過(guò)氧化物酶，作為一種新型炎癥細(xì)胞因子與機(jī)體免疫有關(guān)，可能通過(guò)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等誘發(fā)疾病的發(fā)生[15]。MPO可能通過(guò)急性期炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激參與終末期腎病的病理過(guò)程[16]。研究發(fā)現(xiàn)MPO抑制體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]；MPO和IL-6在急性心肌梗死患者中高表達(dá)，可作為急性心肌梗死的早期診斷標(biāo)記物[18]。高糖能使腎小球系膜細(xì)胞上清液中MPO活性增加，導(dǎo)致人腎小球系膜細(xì)胞氧化失衡[19]。抗MPO抗體可作為腎炎臨床鑒別診斷的參考指標(biāo)[20]。IL-6、TNF-α也是炎癥相關(guān)因子，在糖尿病患者中含量較高，TNF-α可反映糖尿病患者腎臟損傷程度[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-30c-2-3p靶向調(diào)控MPO的表達(dá)，過(guò)表達(dá)MPO能逆轉(zhuǎn)miR-30c-2-3p過(guò)表達(dá)對(duì)高糖作用的HMC細(xì)胞凋亡及IL-6、TNF-α表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，miR-30c-2-3p能抑制高糖作用的HMC細(xì)胞凋亡，其機(jī)制主要是下調(diào)MPO及炎性因子IL-6、TNF-α的表達(dá)?？蔀樘悄虿∧I病的治療提供新思路和新靶點(diǎn)。