張曉琳 劉穎 竇博鑫

摘要：以大豆分離蛋白（SPI）為原料，探討轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）對其起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，并對改性前后SPI的粒徑、Zeta電位、游離巰基含量等理化性質(zhì)與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性進行分析。結(jié)果表明，TGase酶量40 U/g，pH值6.0，交聯(lián)溫度45 ℃，交聯(lián)時間2 h為改善起泡性及泡沫穩(wěn)定性的最優(yōu)條件，此時起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別為52.65%，86.52%，較SPI原料分別提高46.66%，14.16%。粒徑大小與起泡性和泡沫穩(wěn)定性之間均存在顯著正相關(guān)性（p<0.01），Zeta電位絕對值大小與起泡性之間呈顯著正相關(guān)（p<0.01），游離巰基含量與起泡性之間呈顯著負相關(guān)（p<0.01），與泡沫穩(wěn)定性之間呈負相關(guān)（p<0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.752，0.623，0.672，-0.601，-0.475。

關(guān)鍵詞：大豆分離蛋白;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶;起泡性;泡沫穩(wěn)定性;相關(guān)性

中圖分類號：TS201.2? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A? ? doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.01.039

Abstract：Soy protein isolate（SPI）was used as raw material. The effect of transglutaminase（TGase）on its foaming capacity and foaming stability were investigated. Correlation analysis between physical and chemical properties such as particle size，Zeta potential and free sulfhydryl content before and after modification，foaming capacity and foaming stability were carried out. The results showed that the optimum conditions for improving foaming capacity and foaming stability were TGase amount 40 U/g，pH 6.0，temperature 45 ℃ and time 2 h. Under these conditions，the foaming capacity and foaming stability were 52.65% and 86.52%，respectively. Compared with SPI raw materials，they increased by 46.66% and 14.16% respectively. The particle size had a significant positive correlation（p<0.01）with foaming capacity and foaming stability，and the absolute value of Zeta potential had a significant positive correlation（p<0.01）with foaming capacity. There was a significant negative correlation（p<0.01）between free sulfhydryl content and foaming capacity，and a negative correlation（p<0.05）between free sulfhydryl content and foaming stability. The correlation coefficients were 0.752，0.623，0.672，-0.601，-0.475，respectively.

Key words：soy protein isolate;transglutaminase;foaming capacity;foaming stability;correlation analysis

大豆分離蛋白（SPI）是一種蛋白質(zhì)含量在90%以上的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，是具有起泡性、乳化性、溶解性、凝膠性等多種功能性質(zhì)的常用食品基料。大豆分離蛋白因其較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值及在食品體系中具有良好功能特性的優(yōu)點，在食品加工領(lǐng)域備受重視[1]。起泡性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于食品加工的一項重要功能性質(zhì)，是影響多糖食品質(zhì)量好壞的關(guān)鍵性因素[2]。許多加工食品，如冰激凌、蛋奶酥、奶油、蛋糕、面包、啤酒等均為泡沫型產(chǎn)品。然而，天然大豆分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定能力并不理想，因此限制了其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用[3]。通過對大豆蛋白進行改性可以有效提高其起泡性，常用的改性方法有物理、化學(xué)及酶法改性，其中酶法改性具有高效性、專一性、多樣性、溫和性和無副產(chǎn)物等優(yōu)點，對食物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)也無破壞作用[4]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Transglutaminase，TGase）是一種由331個氨基組成的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)，可以催化蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián)，從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[5]，尤其對蛋白質(zhì)起泡性、乳化性、熱穩(wěn)定性和凝膠性能等改善效果顯著，進而改善食品的口感風(fēng)味、質(zhì)地外觀等，因此轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在食品加工業(yè)中的應(yīng)用頗受關(guān)注[6]。

試驗以大豆分離蛋白（SPI）為原料，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase）在不同條件下對其進行交聯(lián)作用，研究TGase改性對大豆分離蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，并對改性前后粒徑、Zeta電位、游離巰基含量等理化性質(zhì)與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性進行探討。

1? ?材料與方法

1.1? ?主要材料與儀器

大豆分離蛋白，臨沂山松生物制品有限公司提供;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（130 U/g），江蘇一鳴生物股份有限公司提供;Ellman試劑，南京杜萊生物技術(shù)有限公司提供。

BS224S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;pHS-3C型精密pH計，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品;SY-24型恒溫水浴鍋，天津歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品;202型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;TG16-WS型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品;XHF-DY型高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品;Malvern激光粒度儀，上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品;722S型分光光度計，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ?TGase交聯(lián)SPI對其起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響

將SPI配制成質(zhì)量分數(shù)為5%的溶液，調(diào)整pH值后加入一定量的TGase，在指定溫度下交聯(lián)一段時間，交聯(lián)結(jié)束后在80 ℃下滅酶5 min，獲得交聯(lián)物后取出，烘干備用[7]。分別探討加酶量、pH值、溫度和時間4個因素對TGase改善SPI起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響。

（1）TGase酶量。以SPI溶液為底物，TGase酶量分別為10，20，30，40，50 U/g，在pH值7.0，溫度55 ℃，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（2）pH值。以SPI溶液為底物，分別調(diào)節(jié)pH值至5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在TGase酶量40 U/g，溫度55 ℃，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（3）交聯(lián)溫度。以SPI溶液為底物，交聯(lián)溫度分別為25，35，45，55，65 ℃，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

（4）交聯(lián)時間。以SPI溶液為底物，交聯(lián)時間分別為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h，在TGase酶量40 U/g，pH值6.0，溫度45 ℃的條件下進行交聯(lián)作用，測定TGase改性后樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。

1.2.2? ?起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測定

用去離子水配制1%的蛋白溶液，振蕩30 min充分溶解后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，再取30 mL上清液于高速分散器中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min均質(zhì)? 1 min，記錄泡沫體積（V0，mL），靜置30 min后，再次記錄泡沫體積（V30，mL）[8]。按以下公式分別計算樣品的起泡性（Foaming Capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（Foaming Stability，F(xiàn)S）：

1.2.3? ?粒徑與Zeta電位的測定

分別取0.1 g SPI原料與不同交聯(lián)時間下的樣品溶解于10 mL去離子水中，使用高速分散器以轉(zhuǎn)速 5 000 r/min均質(zhì)2 min完全混合，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后取上清液，用0.45 μm膜過濾后，測定粒徑及Zeta電位[9]。

1.2.4? ?游離巰基含量的測定

采用Ellman法[10]測定游離巰基（SH）含量，取15 mg樣品溶于5 mL Tris-Gly-8 M Urea溶液中振蕩，加入100 μL Ellman試劑，于25 ℃下保溫30 min，再以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心15 min，取上清液，于波長412 nm處測定吸光度，以試劑空白校零，同時測定樣品空白。按以下公式計算游離巰基含量：

式中：A412——除去樣品空白和試劑空白后的吸光度;

D——稀釋倍數(shù);

C——樣品中蛋白質(zhì)含量，g/L;

13 600——Ellman試劑摩爾吸光系數(shù)，M-1cm-1。

1.2.5? ?數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Office Excel 2007軟件繪圖，SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)，每組試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用t檢驗，當(dāng)p<0.05 時，表示差異顯著。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?TGase改善SPI起泡性、泡沫穩(wěn)定性研究

2.1.1? ?SPI原料的起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定結(jié)果

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)，通過公式（1）及（2）計算得到SPI原料的起泡性為35.90%，泡沫穩(wěn)定性為75.79%。

2.1.2? ?TGase交聯(lián)SPI對其起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

不同因素對TGase交聯(lián)SPI起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響見圖1。

由圖1（a）可知，隨著TGase酶的加入，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性也隨之增強，當(dāng)酶用量為40 U/g時均達到最大，分別為42.07%和76.14%，之后呈現(xiàn)下降趨勢?？赡苁怯捎诿赣昧康脑黾邮沟妹概c蛋白的接觸概率增大，蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，膜上吸附的改性蛋白分子增加，膜的彈性及致密性提高，氣體不易向外擴散[11]，因此利于起泡，同時泡沫存在的時間也會延長。但TGase酶的過度加入則會破壞體系所需要的親水平衡，導(dǎo)致其起泡性和泡沫穩(wěn)定性降低，所以確定最優(yōu)酶用量為40 U/g。

由圖1（b）可知，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均先升高后降低，當(dāng)pH值為6.0時達到最大，分別為45.95%和79.63%。由此可分析出，pH值對TGase交聯(lián)SPI的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有影響。大豆蛋白質(zhì)在pH值4.5左右時達到等電點，此時溶解度最低，易于形成沉淀，而起泡性和泡沫穩(wěn)定性均與溶解度有關(guān)[12]，所以在等電點附近，其起泡性和泡沫穩(wěn)定性較低，在遠離等電點后呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢?？扇苄缘鞍讌⑴c泡沫的形成，在等電點處可溶性蛋白濃度很低，形成的泡沫量很少。當(dāng)pH值為6.0時，不溶性蛋白吸附在界面上，蛋白膜的黏著力增加，此時的體系有利于泡沫的形成[13]。隨著pH值的升高，溶液環(huán)境堿性增強，酶的活性隨之降低，使穩(wěn)定環(huán)境受到破壞，導(dǎo)致其起泡性和泡沫穩(wěn)定性減弱[14]，因此確定最佳pH值為6.0。

由圖1（c）可知，起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度為45 ℃時達到峰值，分別為49.55%和81.91%，而后二者均下降。之所以出現(xiàn)此趨勢可能是因為TGase酶有自身的最適溫度，過低或過高都不利于TGase酶對SPI的交聯(lián)，而一定程度的交聯(lián)使蛋白分子疏水基團暴露，增加其吸附至界面的能力[15]。在最適溫度時，酶交聯(lián)反應(yīng)速率最大，使蛋白分子得以最大程度的交聯(lián)。當(dāng)高于最適溫度時，反應(yīng)速率減小，同時蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會遭到不同程度破壞，使蛋白質(zhì)與水的相互作用被削? ?弱[16]，導(dǎo)致起泡性和泡沫穩(wěn)定性降低。另外，觀測到在45 ℃時產(chǎn)生的泡沫黏度比在其他溫度條件下產(chǎn)生的略大，說明此溫度下的泡沫穩(wěn)定性最好。綜上確定交聯(lián)反應(yīng)的最適溫度為45 ℃。

由圖1（d）可知，隨著交聯(lián)時間的延長，交聯(lián)樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均隨之增強，交聯(lián)時間2 h時達到最大值，分別為52.65%和86.52%，而后略有下降。原因可能是在反應(yīng)初期，隨著時間的延長，蛋白分子中-NH2、-COOH之間形成的氫鍵增加，致使蛋白膜之間的機械強度提高[17]，從而起泡性提高。當(dāng)反應(yīng)時間過長時，氣液兩相間薄膜強度降? ?低[18]，故泡沫穩(wěn)定性下降，起泡性也隨之下降。綜上確定交聯(lián)反應(yīng)的最適時間為2 h。

2.2? ?起泡性、泡沫穩(wěn)定性與理化性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系

2.2.1? ?粒徑與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

粒徑與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見? ?圖2。

SPI經(jīng)TGase酶的交聯(lián)作用使其粒徑增大，通過SPSS軟件中相關(guān)性分析得出，粒徑大小與起泡性（R=0.752）和泡沫穩(wěn)定性（R=0.623）之間均存在顯著正相關(guān)性（p<0.01），由圖2（a）與（b）可知，這與楊峰等人[19]得出的結(jié)論一致。

2.2.2? ?Zeta電位與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

電位與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見圖3。

由圖3（a）可知，可以看出隨著Zeta電位絕對值的增加，其起泡性會出現(xiàn)明顯的上升趨勢。通過相關(guān)性分析得出，Zeta電位絕對值的大小與起泡性之間呈顯著正相關(guān)（R=0.672，p<0.01）。但Zeta電位絕對值的大小與泡沫穩(wěn)定性之間并不存在相關(guān)性（R=0.399，p>0.05）。

2.2.3? ?游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性分析

游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的相關(guān)性見圖4。

SPI經(jīng)TGase酶的交聯(lián)后，產(chǎn)物的游離巰基含量會發(fā)生變化。游離巰基含量的多少對大豆分離蛋白功能性質(zhì)的影響很大，巰基是形成二硫鍵的原體，巰基和二硫鍵在蛋白分子結(jié)構(gòu)中起到重要的作用[20]。經(jīng)酶法改性后的蛋白多肽鏈構(gòu)象的改變反映在巰基及二硫鍵含量的變化上，故探討其對交聯(lián)產(chǎn)物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響。

圖4（a）為游離巰基含量與起泡性之間的關(guān)系。由SPSS軟件中相關(guān)性分析得出，游離巰基含量與起泡性之間呈顯著負相關(guān)（R=-0.601，p<0.01）。游離巰基含量少，起泡性反而大。游離巰基含量的變化引起其起泡性的顯著變化，說明游離巰基的含量可以影響其起泡性能，同時也驗證了交聯(lián)作用的發(fā)生。通過分析圖4（b）中游離巰基的含量與泡沫穩(wěn)定性相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，泡沫穩(wěn)定性與游離巰基含量之間的相關(guān)性稍差，游離巰基含量的變化并未導(dǎo)致其泡沫穩(wěn)定性顯著的升高或降低。由相關(guān)性分析可得出，游離巰基含量與泡沫穩(wěn)定性之間僅存在微弱的負相關(guān)性（R=-0.475，p<0.05）。

3? ?結(jié)論

以大豆分離蛋白為試驗原料，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在不同條件下交聯(lián)，探討酶用量、pH值、交聯(lián)溫度和交聯(lián)時間4個因素對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改善大豆分離蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響，確定酶用量? ? ? ?40 U/g，pH 值6.0，交聯(lián)溫度45 ℃，交聯(lián)時間2 h為改善起泡性和泡沫穩(wěn)定性的最優(yōu)條件，此時起泡性為52.65%，較SPI原料提高46.66%;泡沫穩(wěn)定性為86.52%，較SPI原料提高14.16%。

通過分析粒徑、Zeta電位、游離巰基含量與起泡性、泡沫穩(wěn)定性之間的關(guān)系，得到以下結(jié)論：粒徑大小與起泡性和泡沫穩(wěn)定性之間均存在顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.752和0.623（p<0.01）。Zeta電位絕對值的大小與起泡性之間呈顯著正相關(guān)（R= 0.672，p<0.01），但與泡沫穩(wěn)定性之間并不存在相關(guān)性（R=0.399，p>0.05）。游離巰基含量與起泡性之間呈顯著負相關(guān)（R=-0.601，p<0.01），與泡沫穩(wěn)定性之間呈負相關(guān)（R=-0.475，p<0.05）。

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