于 洋，曹雅男，宋旭東，蘇曉男，史嘉翊，吳 丹

(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江 牡丹江 157011)

肝纖維化(Liver fibrosis)是大多數(shù)慢性肝病的組織學(xué)特征，可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[1]。主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)大量沉積，肝纖維化狀況可以用來評估肝病的嚴重程度[2]。肝纖維化早期可被逆轉(zhuǎn)，因此及時有效的干預(yù)可以減少肝病的發(fā)生、發(fā)展[3]。目前認為大鼠肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖是導(dǎo)致肝纖維化的關(guān)鍵過程[4]。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)是潛在的纖維化形成細胞因子，能夠促進HSC活化[5]，與肝纖維化形成有關(guān)。TGF-β最初由位于N端的LAP與成熟型TGF-β以非共價鍵結(jié)合形成復(fù)合物的形式存在，該復(fù)合物不具有生物活性。當(dāng)釋放至胞外時，受蛋白酶或整合素作用，使LAP裂解或者改變其空間構(gòu)型，具有活性的成熟型的TGF-β才被釋放，發(fā)揮生物活性[6]，因此LAP蛋白對TGF-β活化至關(guān)重要。

本實驗室前期設(shè)計7個LAP截短的引物序列，利用基因工程技術(shù)，擴增全長及截短LAP有效片段。本實驗小量試誘導(dǎo)表達截短型LAP-B重組蛋白，并純化目的多肽，考察LAP截短型多肽對HSC-T6細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料7個LAP重組質(zhì)粒、大腸桿菌C43感受態(tài)細胞(牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心)，細胞株HSC-T6(中國科學(xué)院上海細胞庫)。

1.2 主要試劑與儀器酵母提取物、蛋白胨(Oxoid公司)；氯化鈉(Solarbio公司)；咪唑(Imidazole) (Solarbio公司)；異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG) (biofroxx公司)；苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) (Thermo Scientific公司)；鎳親和層析柱(Ni-NTA Agarose) (上海凱杰生物有限公司)；蛋白分子量Marker(Bio-rad公司)；胰蛋白酶、DMEM、胎牛血清(HyClone公司)；MTT試劑(Solarbio公司)；離心機、恒溫培養(yǎng)搖床(Eppendorf公司)；倒置生物顯微鏡(Olympus公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)。

1.3 方法

1.3.1 LAP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化C43感受態(tài)細胞及誘導(dǎo)表達檢測 分別將1μL的LAP重組質(zhì)粒加入到50μL的C43中，放置冰上30min。42℃水浴中90s進行熱休克后迅速放回冰中，靜置2min。在超凈工作臺中加入400μL LB培養(yǎng)基(不含抗生素)輕輕混勻，固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。取上述轉(zhuǎn)化混合液200μL，分別添加到終濃度為50μg/mL卡那霉素固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的涂布棒涂布均勻，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～14 h。挑取7個截斷型LAP重組質(zhì)粒陽性克隆于5mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床中過夜培養(yǎng)。次日將過夜培養(yǎng)的菌液按1:200比例分別接種于10mL LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)4h至OD600為0.8，添加終濃度為0.3mM的IPTG 37℃誘導(dǎo)16h。將過夜培養(yǎng)的菌液4℃，4000rpm離心15min后棄上清，收集的菌體用500μL重懸液(25mmol/L Tris 8.0, 200mmol/L NaCl)重懸，加入2mM PMSF，置冰水浴中超聲破碎菌體，功率調(diào)為80w，超聲工作頻率為工作3s，停歇5s，共5次。4℃，13000rpm離心40min收集上清。將上清與30μL鎳柱瓊脂糖凝膠(Ni-NTA Beads)置于4℃層析柜結(jié)合1h，離心棄上清，加入500μL的清洗液(25mmol/L Tris, 200mmol/L NaCl，15mmol/L Imidazole)清洗雜蛋白，重復(fù)2次。分別取Ni Beads 20μL，將樣品加入5SDS上樣緩沖液煮沸10min，SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.2 重組截短型LAP-B蛋白的大量誘導(dǎo)表達及純化 將培養(yǎng)的截短型LAP-B菌液按1:200的比例接種于5mL的LB液體培養(yǎng)基中，按1.3.1進行誘導(dǎo)蛋白及鎳柱親和純化。上清全部通過鎳層析柱并清洗雜蛋白后，加6mL洗脫液(25mmol/L Tris 8.0，200mmol/L NaCl，300mmol/L Imidazole)洗脫目的蛋白，靜置30min，收集洗脫液，重復(fù)2次。將純化后的目的蛋白用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝，-80℃保存。取樣進行SDS-PAGE檢測。

1.3.3 HSC-T6細胞傳代培養(yǎng) 細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次，加0.25%胰蛋白酶消化約1min，倒置顯微鏡下觀察細胞回縮變圓時加入培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，將懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min。棄上清，沉淀培養(yǎng)基重懸，按1∶2比例分瓶傳代，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞完全貼壁后，進行換液培養(yǎng)或傳代。

1.3.4 MTT檢測LAP-B對TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6細胞增殖的影響 將培養(yǎng)瓶的細胞用胰蛋白酶消化后，計數(shù)細胞，96孔板中接種HSC-T6細胞0.5×104個/孔，體積為100μL，并設(shè)置5個復(fù)孔。實驗設(shè)有空白對照組、TGF-β活化組、6個不同濃度的重組蛋白LAP-B給藥組(2、4、8、16、32、64μg/mL組)，TGF-β活化組和LAP-B給藥組均給予TGF-β 10ng/mL活化細胞。藥物作用時間達到72h后，加入MTT溶液20μL，孵育4h后加DMSO 150μL，震蕩10min，檢測OD490的吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 截短型LAP各個片段的組成信息人源LAP片段大小為747 bp，本實驗室前期設(shè)計的7個截短型LAP片段，LAP-A為(1-411 bp)、LAP-A1為(1-195 bp)、LAP-A2為(1-300 bp)、 LAP-A4為(229-441 bp)、LAP-B為(229-747 bp)、LAP-B2為(577-747 bp)、LAP-C為(229-576 bp)，見圖1。利用基因克隆構(gòu)建了這些LAP片段的原核表達載體。本實驗將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C43中。

圖1 LAP截短蛋白重組信息

2.2 LAP重組蛋白小量誘導(dǎo)表達檢測7個LAP重組質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化后進行小量37℃培養(yǎng)，IPTG低溫誘導(dǎo)表達，超聲破碎離心后與鎳柱親和，分別取樣進行SDS-PAGE電泳。LAP各截短片段預(yù)期大小分別為LAP-A(18.78 kd)、LAP-A1(10.88 kd)、LAP-A2(14.94 kd)、LAP-A4(12.39 kd)、LAP-B(24 kd)、LAP-B2(10.32 kd)、LAP-C(17.39 kd)。結(jié)果表明，LAP-B有可溶表達，大小24 kd，與預(yù)期大小一致，其余截短LAP重組蛋白大多為包涵體表達，見圖2。

圖2 截短LAP重組蛋白小試SDS-PAGE檢測結(jié)果注：M為Protein Marker；A、A1、A2、A4、B、B2、C為各個截短片段的LAP重組蛋白

2.3 LAP-B大量誘導(dǎo)表達及純化LAP-B經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)表達，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶形式存在，可進一步純化。將LAP-B大量誘導(dǎo)表達，利用鎳柱親和純化重組蛋白，洗脫目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果表明：經(jīng)鎳柱純化成功得到高純度的截短型LAP-B重組蛋白，見圖3。

圖3 a為LAP-B重組蛋白清洗雜蛋白SDS-PAGE圖； b為LAP-B重組蛋白洗脫蛋白SDS-PAGE圖注：M為protein marker；C為全菌；SN為上清；R15為清洗后的Ni-NTA beads；E為洗脫蛋白；ER為洗脫后的Ni-NTA beads

2.4 MTT檢測TGF-β誘導(dǎo)HSC-T6細胞增殖結(jié)果不同濃度的LAP-B重組蛋白作用于TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6細胞72h測其OD490值，結(jié)果顯示TGF-β活化組與對照組相比，其細胞活性升高；與模型組相比，2μg/mL、4μg/mL的LAP-B組對細胞增殖抑制的作用不明顯(P>0.05)，細胞活性仍比較旺盛；8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL的LAP-B組對細胞增殖均有明顯的抑制作用(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并且呈現(xiàn)劑量依賴性的趨勢，表明LAP-B在2～64 μg/mL濃度范圍內(nèi)可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6細胞增殖，見圖4。

圖4 MTT檢測不同濃度LAP-B對TGF-β誘導(dǎo)HSC-T6細胞活性的影響注：與模型組比較，#P<0.05，###P<0.001

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷自我調(diào)節(jié)的方式，主要病理特征是ECM在肝內(nèi)過量沉積。TGF-β是肝纖維化中上調(diào)膠原基因轉(zhuǎn)錄的重要成分[7]，刺激HSC的生成，從而促進肝纖維化的進展。TGF-β/Smad信號通路在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中有重要調(diào)控作用，可以通過抑制TGF-β的生成，拮抗TGF-β受體，抑制Smads蛋白磷酸化以及調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。有研究表明[8]通過腺病毒傳遞的轉(zhuǎn)基因構(gòu)成性表達TGF-β1反義mRNA可以阻斷HSC的合成。另有研究表明[9]構(gòu)建截短的胞內(nèi)段TβRⅡ可競爭結(jié)合配體阻斷TGF-β信號傳遞。TGF-β調(diào)節(jié)大量的細胞內(nèi)信號級聯(lián)來傳遞其促纖維化作用，通過調(diào)控Smad信號通路也可抑制HSC的增殖[10]。TGF-β最初被合成為前體蛋白，在酶的作用下形成LAP與TGF-β無生物活性的復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物分泌到細胞外時，經(jīng)過復(fù)雜的處理過程，LAP被解離出來，這時TGF-β才能發(fā)揮活性作用。因此LAP是TGF-β活化過程中重要的蛋白，本實驗室前期通過構(gòu)建不同截短片段的LAP，旨在與野生型的LAP競爭結(jié)合TGF-β，抑制TGF-β的活化[11]。

本實驗通過小量試表達7個截短LAP重組蛋白，檢測到LAP-B有可溶表達，其他大多為包涵體表達。石永萍等[11]通過包涵體的方式純化出截短型LAP-B2，并發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能夠抑制HSC-T6細胞的增殖?？紤]到包涵體表達需要胞外折疊，得率較低，且蛋白行為沒有可溶表達的好[12]，因此本實驗選擇LAP-B可溶重組蛋白進行IPTG誘導(dǎo)表達。因重組蛋白的表達載體為PET28a，帶His標簽，因此選擇鎳柱親和純化。將LAP-B作用于HSC-T6細胞，發(fā)現(xiàn)在濃度為2～64 μg/mL范圍內(nèi)LAP-B對HSC-T6細胞沒有毒性作用。因此選擇該濃度范圍的LAP-B作用于TGF-β誘導(dǎo)的HSC-T6細胞，檢測其對HSC-T6細胞的增殖影響，發(fā)現(xiàn)在2～64 μg/mL范圍內(nèi)LAP-B顯著抑制HSC-T6細胞的增殖，并隨著劑量的增加，抑制該細胞增殖越顯著。下一步擬做LAP-B重組蛋白對HSC-T6細胞的功能實驗，為后續(xù)研究LAP重組多肽的抗肝纖維化作用提供新思路。