懷自友，黃銀久，吳 迪，胡少聰，范夢(mèng)園，陳培培

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.生命科學(xué)學(xué)院；2.第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科，安徽 蚌埠 233000)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-2]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，NSCLC的5年生存率約為31%～42%[3]。目前NSCLC的治療手段還是手術(shù)結(jié)合放化療為主，傳統(tǒng)的化療藥物大多屬于非特異性藥物，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞損傷也較大，有很多毒副作用，效果也不理想，同時(shí)容易產(chǎn)生耐藥。因此，研發(fā)出高效、安全、易獲得的化療藥物是治療NSCLC的必要手段[4]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，研究表明，NSCLC患者中，EGFR突變率為36.5%[5]。從姜科植物中提取的多酚類物質(zhì)姜黃素具有抗菌，抗腫瘤作用，因其能抑制EGFR表達(dá)而被廣泛關(guān)注[6]。1,4-戊二烯-3-酮類化合物作為姜黃素的衍生物具有同樣的抗菌抗癌活性，我們將同樣具有抗癌活性的喹喔啉基團(tuán)引入1,4-戊二烯-3-酮，合成一系列化合物，經(jīng)初步篩選，N2(結(jié)構(gòu)式見圖1)表現(xiàn)出很好的抗癌活性。為了進(jìn)一步研究N2對(duì)腫瘤的抑制作用，我們以A549細(xì)胞作為研究對(duì)象，利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞毒性，DAPI染色觀察細(xì)胞核變化，羅丹明123測(cè)線粒體跨膜電位，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期等技術(shù)方法，測(cè)試N2對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制，并初步探討其機(jī)制，為抗腫瘤藥物開發(fā)提供研究方向。

圖1 N2化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料和方法

1.1 材料與試劑人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞在蚌埠醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院復(fù)蘇；N2由貴州大學(xué)精細(xì)化工研究中心薛偉教授課題組合成；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)；胎牛血清(VACCA)；胰酶，PBS，青-鏈霉素混合液，二甲基亞砜(DMSO)，Triton X-100(biosharp)；cck-8，DAPI，4%多聚甲醛，羅丹明123，細(xì)胞凋亡試劑盒，細(xì)胞周期試劑盒(碧云天)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物配制 A549細(xì)胞用含1%青-鏈霉素混合液，10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換一次液，3～4d傳代一次。N2和吉非替尼用DMSO溶解成20mM、10mM、5mM、2mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM的儲(chǔ)存液，加藥前用完全培養(yǎng)基稀釋1000倍成工作液。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)IC50 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度在2.0×104個(gè)/mL左右。板四周每孔各加200μL的無(wú)菌水封邊，確保實(shí)驗(yàn)中飽和濕度，最后一列為空白對(duì)照組，加相同體積的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取20mM、10mM、5mM、2mM、1mM、0.5mM、0.2mM、0.1mM的N2 0.3μL加入到300μL完全培養(yǎng)基中，混勻備用。96孔板細(xì)胞去上清，每孔加入100μL混勻備用的帶藥培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔，作用濃度分別為20μM、10μM、5μM、2μM、1μM、0.5μM、0.2μM、0.1μM。DMSO 和吉非替尼分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照做相同處理，空白對(duì)照組加100μL的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。加藥后24h、48h、72h，在倒置顯微鏡下觀察藥物作用效果并拍照。72h后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，上下左右晃動(dòng)使CCK-8充分混勻。37℃繼續(xù)培養(yǎng)3h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450,計(jì)算每孔的抑制率。利用GraphPad prism分別計(jì)算N2和吉非替尼在24h、48h、72h的IC50值。

抑制率(%)=(1-(處理組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值))×100%

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 上述在96孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，分別在加藥后的24h、48h、72h拍照，對(duì)比觀察加藥組與陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的差異。

1.2.4 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約3.0×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，用培養(yǎng)基將N2和吉非替尼稀釋1000倍至20μM、10μM、5μM、1μM，去除原培養(yǎng)液，加入新的帶藥培養(yǎng)基，DMSO用培養(yǎng)基稀釋1000倍作為陰性對(duì)照組。48h后，去上清，每孔1mL PBS洗兩次后加入0.3mL 4%多聚甲醛固定10min，去除多聚甲醛，PBS洗兩次，每孔加入0.3mL 0.2% Triton X-100，37℃孵育10min，去除T riton X-100，PBS洗兩次，每孔加入30μL DAPI，37℃染色10min，去除DAPI，PBS洗兩次，每孔加入0.3mL PBS，倒置熒光顯微鏡拍照。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔約2.0×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，細(xì)胞完全貼壁后，培養(yǎng)基將N2儲(chǔ)存液稀釋1000倍至20μM、10μM、5μM、1μM，去除原培養(yǎng)液，加入新的帶藥培養(yǎng)基，20μM的吉非替尼作為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO作為陰性對(duì)照做相同處理。作用48h后，參照碧云天細(xì)胞凋亡試劑盒(C1063)操作步驟處理細(xì)胞，BD FACSVerse檢測(cè)各組凋亡情況。

1.2.6 羅丹明123法檢測(cè)線粒體跨膜電位(△Ψm) 細(xì)胞種板與藥物處理同1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)細(xì)胞凋亡。藥物作用48h后，0.25%胰酶(不含EDTA)消化細(xì)胞1～2min，離心收集細(xì)胞，用1mL PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，離心收集細(xì)胞，加1mL羅丹明123工作液重懸細(xì)胞，避光孵育30min，離心收集細(xì)胞，PBS重懸后轉(zhuǎn)入流式管，BD FACSVerse上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 碘化丙啶(PI)染色檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞種板與藥物處理同1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)細(xì)胞凋亡。藥物作用48h后，參照碧云天細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1052)操作步驟處理細(xì)胞，BD FACSVerse檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用spss statistics 17.0單因素分析，采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，以P<0.05表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 cck-8檢測(cè)結(jié)果通過(guò)檢測(cè)各組在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度并利用SPSS分析均值發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制率不斷升高，與DMSO組相比N2 在0.2μM以上濃度的抑制率均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。且在20μM相同濃度下，N2對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用要高于陽(yáng)性對(duì)照吉西他濱(見表1)。 GraphPad prism計(jì)算N2和吉非替尼在24h、48h、72h的IC50值顯示，N2在48h、72h的IC50為6.61μM、5.68μM，低于吉非替尼的11.93μM、7.18μM，表現(xiàn)出更高的抑制作用(見表2、圖2)。

表1 不同濃度梯度N2、吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞作用不同時(shí)間的體外抑制率

表2 N2和吉非替尼作用A549細(xì)胞24h、48h、72h的IC50(μM)

圖2 N2和吉非替尼作用A549細(xì)胞24h、48h、72h的IC50(μM)

2.2 形態(tài)學(xué)通過(guò)觀察細(xì)胞形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)N2作用A549細(xì)胞后，隨著藥物濃度增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用明顯增加。與陰性對(duì)照DMSO組相比，N2作用72h，2μM以上組細(xì)胞數(shù)目明顯減少細(xì)胞形態(tài)變化不大，與陽(yáng)性對(duì)照組作用相似，說(shuō)明N2通過(guò)正常的生理途徑抑制了細(xì)胞的增殖而非通過(guò)細(xì)胞毒性直接殺死腫瘤細(xì)胞(見圖3)。

圖3 N2對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

2.3 DAPI染色觀察細(xì)胞凋亡情況凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)凝集，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)是一種能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，通過(guò)DAPI染細(xì)胞核，倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，加藥組隨著濃度增大，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核皺縮，變小，變亮，與吉非替尼組作用相似。提示N2 誘導(dǎo)了A549細(xì)胞發(fā)生凋亡(見圖4)。

圖4 DAPI染色細(xì)胞核變化

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況早期凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)磷酯酰絲氨酸外翻，通過(guò)FITC標(biāo)記的Annexin V能特異的結(jié)合到外翻的磷酯酰絲氨酸上而發(fā)出綠色熒光，晚期凋亡的細(xì)胞由于細(xì)胞膜完整性喪失，碘化丙啶能夠透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞核的DNA結(jié)合而發(fā)出紅色熒光。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡逐漸上升，且由早期凋亡走向晚期凋亡，N2-20μM組效果顯著，早凋和晚凋比例分別為19.8%和21.8%，明顯優(yōu)于吉非替尼-20μM組1.11%和1.77%(圖5)。

圖5 細(xì)胞凋亡變化

2.5 線粒體跨膜電位(△Ψm)變化早期凋亡細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)線粒體跨膜電位的降低或喪失，通過(guò)羅丹明123染色可以檢測(cè)線粒體跨膜電位的變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與DMSO組相比，加藥組線粒體跨膜電位向左偏移，△Ψm下降，且隨著藥物濃度加大△Ψm下降程度增加，說(shuō)明隨著藥物濃度增加細(xì)胞凋亡率升高(見圖6)。

圖6 線粒體跨膜電位變化

2.6 細(xì)胞周期變化碘化丙啶(PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比,處于不同期的細(xì)胞由于DNA含量不同，所以熒光強(qiáng)度不同。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，DMSO組G1和S期細(xì)胞比例為18.54%、49.98%，藥物處理組隨著濃度增大，G1期細(xì)胞比例增加S期細(xì)胞比例降低，N2-20μM組G1和S期細(xì)胞比例分別為50.52%、26.47%，出現(xiàn)了明顯的G1期阻止，通過(guò)抑制細(xì)胞周期從G1期走向S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，見圖7。

圖7 細(xì)胞周期變化

3 討論

肺癌是目前癌癥相關(guān)致死的主要原因，非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例的80%[7-8]。目前治療肺癌的化療藥物主要包括廣譜抗癌藥如紫杉醇、長(zhǎng)春瑞濱，順鉑等，吉非替尼、厄洛替尼、?？颂婺崾轻槍?duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(EGFR-TK)為靶點(diǎn)的新一代靶點(diǎn)抗癌藥。姜黃素作為一種新型的EGFR抑制劑，為抗腫瘤藥物開發(fā)提供了方向。我們合成了姜黃素衍生物N2，并通過(guò)體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，N2作用于非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，相比DMSO組，細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞核皺縮變小，線粒體跨膜電位降低，凋亡率明顯升高，細(xì)胞周期出現(xiàn)明顯的G1期阻滯。猜測(cè)N2可能通過(guò)抑制G1期必須蛋白的合成從而阻斷細(xì)胞周期，打破線粒體膜電位平衡，使線粒體跨膜電位降低，ATP合成受阻，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。