丁如嵐，黃詩豪，羅宜孝

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410006）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是與創(chuàng)傷經(jīng)歷有關(guān)的腦部疾?。?］，不僅損害個人健康，并且對社會發(fā)展也造成了嚴(yán)重的影響。然而，對于PTSD目前尚無有效的治療方法。研究表明對條件性恐懼記憶的再鞏固階段進(jìn)行干預(yù)，可以破壞條件性恐懼記憶，達(dá)到預(yù)防PTSD復(fù)發(fā)的目的［2-4］。應(yīng)激對于記憶的不同階段發(fā)揮了十分復(fù)雜的作用［5，6］，且應(yīng)激是無創(chuàng)傷性療法，不會帶來如藥物副作用等問題，將可能開辟一條PTSD治療的全新途徑。應(yīng)激對UCS誘導(dǎo)條件性恐懼記憶的再鞏固過程中的作用尚不明確。本研究采用條件性恐懼模型研究應(yīng)激對UCS誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶再鞏固過程的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠（體重20～25g）購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0014。小鼠飼養(yǎng)在恒溫（22±2）℃、濕度（約60%），12小時亮/暗循環(huán)（上午7點開始開燈）的動物房中，提供充足的水和飼料。小鼠在動物房適應(yīng)飼養(yǎng)一周，每天進(jìn)行適應(yīng)性抓取。所有的動物實驗操作都根據(jù)湖南省實驗動物管理委員會和湖南師范大學(xué)的動物使用和保護(hù)倫理委員會的條例進(jìn)行。

1.2 實驗設(shè)備條件性恐懼記憶訓(xùn)練箱購自上海欣軟技術(shù)有限公司。箱體底部為與電擊發(fā)生器相連的金屬桿，箱體四周為黑白相間的豎條紋。箱頂部有紅外攝像頭監(jiān)控實驗動物的僵直不動時間。動物視頻分析系統(tǒng)（中國上海JLBeh軟科有限公司所研制）監(jiān)控，自動收集記錄行為學(xué)資料。

1.3 實驗方法

1.3.1 條件恐懼記憶模型（Contextual Fear Conditioning，CFC）

1.3.1.1 CFC訓(xùn)練訓(xùn)練前小鼠搬至條件性恐懼訓(xùn)練室，適應(yīng)2小時后將小鼠放人恐懼箱內(nèi)適應(yīng)2分鐘，給予小鼠3次足底電擊（0.8mA），每次電擊持續(xù)時間1s，間隔120s給予一次電擊，末次電擊后小鼠在訓(xùn)練箱停留1分鐘。

1.3.1.2 CFC記憶測試將小鼠放在訓(xùn)練箱內(nèi)，測試條件與訓(xùn)練一致，無電擊，時間為5分鐘，記錄小鼠的僵直不動時間（freezing time）。僵直不動時間/總測試時間代表CFC記憶的強(qiáng)度。

1.3.1.3 非條件性刺激喚起（UCS retrieval）小鼠放入訓(xùn)練箱后立即給予小鼠1次低電流的足部電擊（0.3mA，1s）進(jìn)行喚起，電擊結(jié)束后立即取出。

1.3.1.4 CFC記憶點燃測試（Priming test）點燃方法與喚起一致，點燃之后24小時進(jìn)行CFC記憶測試。

1.3.1.5 CFC記憶自發(fā)恢復(fù)測試（Spontaneous recovery test）測試方法同CFC記憶測試。

1.3.2 冰水應(yīng)激小鼠放入不透明的塑料圓柱體容器內(nèi)自由游泳5分鐘，只有頭部露出水面。游泳容器直徑和高度分別為20厘米和35厘米，其內(nèi)冰水的高度為20厘米，溫度為0±2 ℃。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理實驗均以結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示，以CFC訓(xùn)練后不同的處理方式作為組間因素，以不同的測試時間作為組內(nèi)因素采用重復(fù)測量方差分析（repeated-measure ANOVA）分析各實驗結(jié)果（見實驗結(jié)果部分），選擇Tukey‘s測試作為post hoc比較。P<0.05認(rèn)為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 非條件性刺激暴露后立即給予冰水應(yīng)激對足底電擊誘導(dǎo)的環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶復(fù)燃的影響在實驗1中，首先建立小鼠CFC記憶模型，根據(jù)不同的處理方式我們將小鼠分為兩組：1）給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC喚起，應(yīng)激組的小鼠足底電擊暴露后（0.3mA）立即給予冰水應(yīng)激（retrieval+ stress）；2）給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC喚起，非應(yīng)激組的小鼠足底電擊暴露后（0.3mA）后放回飼養(yǎng)籠（retrieval）。在第5天進(jìn)行環(huán)境線索誘導(dǎo)的小鼠恐懼反應(yīng)測試。第6天給予小鼠一次足底電擊點燃，第7天進(jìn)行小鼠恐懼反應(yīng)的點燃測試（圖1A）。實驗結(jié)果采用rm-ANOVA分析，以不同的處理方式為組間因素（retrieval，retrieval+stress），以測試時間為組內(nèi)因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。根據(jù)rm-ANOVA結(jié)果顯示，組內(nèi)因素 ［F（3，66）= 5.892，P= 0.001］、組間因素 ［F（1，22）=8.901，P = 0.007］以及交互效應(yīng) ［F（3，66）= 3.033，P = 0.035圖1B］，均有顯著性差異 ［圖1B］，表明在UCS暴露喚起后立即給予冰水應(yīng)激能破壞小鼠CFC記憶的再鞏固過程，并且可以抑制足底電擊點燃誘導(dǎo)的CFC記憶的復(fù)燃。

圖1 非條件性刺激暴露后立即給予冰水應(yīng)激抑制足底電擊誘導(dǎo)的環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶復(fù)燃。（A）實驗流程。（B）小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶測試的僵直不動時間百分比，與Retrieval組相比*P<0.05（n=12）。

2.2 非條件性刺激暴露后立即給予冰水應(yīng)激對小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶自發(fā)恢復(fù)的影響在實驗2中，首先建立小鼠CFC記憶模型，根據(jù)不同的處理方式我們將小鼠分為兩組：1）給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC喚起，應(yīng)激組的小鼠足底電擊暴露后（0.3mA）立即給予冰水應(yīng)激（retrieval+ stress）；2）給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC喚起，非應(yīng)激組的小鼠足底電擊暴露后（0.3mA）后放回飼養(yǎng)籠（retrieval）。在第5天進(jìn)行環(huán)境線索誘導(dǎo)的小鼠恐懼反應(yīng)測試。測試后，小鼠放回飼養(yǎng)籠，14天之后測試CFC記憶的自發(fā)恢復(fù)情況，以觀察UCS喚起后立即給予冰水應(yīng)激對小鼠CFC記憶自發(fā)恢復(fù)的影響（圖2A）。實驗結(jié)果采用rm-ANOVA分析，以不同的處理方式為組間因素（retrieval，retrieval+stress），以不同的測試時間為組內(nèi)因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。結(jié)果顯示，組間因素 ［F（1，19）=1.071，P=0.031；圖2B］、組內(nèi)因素［F（3，57）= 13.865，P=0.000；圖2B］以及交互效應(yīng) ［F（3，57）= 7.522，P=0.000］均有顯著性差異 ［圖2B］，表明在UCS暴露喚起小鼠CFC記憶之后立即給予冰水應(yīng)激能破壞小鼠再鞏固過程，并且可以抑制CFC記憶的自發(fā)恢復(fù)，其持續(xù)時間至少14天。

圖2 非條件性刺激暴露后立即給予冰水應(yīng)激抑制小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶的自發(fā)恢復(fù)。（A）實驗流程。（B）小鼠環(huán)境性恐懼記憶測試的僵直不動時間百分比，與Retrieval組相比，*P<0.05（n=10-11）。

2.3 不進(jìn)行非條件性刺激暴露喚起給予冰水應(yīng)激對小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶的影響在實驗3中，首先建立小鼠CFC記憶模型，根據(jù)不同的處理方式我們將小鼠分為兩組：不給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶喚起，應(yīng)激組的小鼠給予冰水應(yīng)激（no retrieval+ stress）；不給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶喚起，非應(yīng)激組小鼠在飼養(yǎng)籠不做處理（no retrieval）。在第5天進(jìn)行環(huán)境線索誘導(dǎo)的小鼠恐懼反應(yīng)測試。第6天給予小鼠一次足底電擊點燃，第7天進(jìn)行小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼反應(yīng)的點燃測試（圖3A）。實驗結(jié)果采用rm-ANOVA分析，以不同的處理方式為組間因素（No retrieval，No retrieval+stress），以不同的測試時間為組內(nèi)因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。結(jié)果顯示，組內(nèi)有顯著性差異 ［F（3，66）= 5.407，P = 0.002；圖3B］，然而組間［F（1，22）= 0.118，P = 0.734；圖3B］以及交互效應(yīng)［F（3，66）= 0.169，P = 0.917；圖3B］均無顯著性差異，表明在沒有進(jìn)行UCS暴露喚起恐懼記憶的情況下，冰水應(yīng)激對小鼠恐懼記憶的表達(dá)無影響，說明冰水應(yīng)激對UCS暴露誘導(dǎo)的恐懼記憶的再鞏固過程的破壞作用具有喚起依賴性。

圖3 不進(jìn)行非條件性刺激暴露喚起給予冰水應(yīng)激不影響小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶的表達(dá)。（A）實驗流程。（B）小鼠環(huán)境性恐懼記憶測試的僵直不動時間百分比。（n=12）

2.4 非條件性刺激暴露9小時后給予冰水應(yīng)激對環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶表達(dá)的影響在實驗4中，首先建立小鼠CFC記憶模型，根據(jù)不同的處理方式我們將小鼠分為兩組：給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶喚起，應(yīng)激組的小鼠在給予足底電擊（0.3mA）9小時后給予冰水應(yīng)激（retrieval + 9h + stress）；給予UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶喚起，非應(yīng)激組的小鼠在給予足底電擊后（0.3mA）后放回飼養(yǎng)籠（retrieval+ 9h+ no stress）。在第5天進(jìn)行環(huán)境線索誘導(dǎo)的小鼠恐懼反應(yīng)測試。第6天給予小鼠一次足底電擊點燃，第7天進(jìn)行小鼠環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼反應(yīng)的點燃測試（圖4A）。試驗結(jié)果采用rm-ANOVA分析，以處理方式為組間因素（retrieval+ 9h+stress，retrieval+ 9h+ no stress），以不同的測試時間為組內(nèi)因素（Pre-T，Post-T1，Post-T2，Post-T3）。組內(nèi)因素有顯著性差異 ［F（3，60）=11.853，P=0.000］，組間因素 ［F（1，20）= 0.518，P=0.480］以及交互效應(yīng)［F（3，60）= 0.010，P=0.999］均無顯著性差異 ［圖4B］，表明在UCS暴露喚起CFC記憶之后9小時給予冰水應(yīng)激對小鼠恐懼記憶的表達(dá)無影響，說明冰水應(yīng)激對UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶的再鞏固過程的破壞作用具有時間特異性。

圖4 非條件性刺激暴露9小時后給予冰水應(yīng)激不影響環(huán)境關(guān)聯(lián)性條件恐懼記憶表達(dá)。（A）實驗流程。（B）小鼠環(huán)境性恐懼記憶測試的僵直不動時間百分比。（n=11）

3 討論

本研究采用經(jīng)典的小鼠條件恐懼記憶模型，驗證了應(yīng)激對UCS誘導(dǎo)的CFC記憶再鞏固過程的作用。UCS暴露喚起CFC記憶后立即給予冰水應(yīng)激可以有效地降低小鼠的條件性恐懼反應(yīng)在足底電擊點燃誘導(dǎo)的復(fù)燃以及自發(fā)恢復(fù)現(xiàn)象；但是在UCS暴露喚起條件性恐懼記憶后9小時給予冰水應(yīng)激或者在不給予UCS暴露的條件下給予冰水應(yīng)激則不影響小鼠恐懼記憶的表達(dá)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激對UCS誘導(dǎo)的CFC記憶的影響具有明顯的時間特異性和UCS喚起依賴性，與之前大量干預(yù)記憶再鞏固過程的研究特點一致［7，8］。

在應(yīng)激的條件下，腎上腺皮質(zhì)激素進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)能夠?qū)τ洃浀撵柟?、喚起和再鞏固過程產(chǎn)生復(fù)雜的影響［9-11］。應(yīng)激對于記憶不同過程的作用，前期的研究結(jié)論存在爭議，一些研究表明應(yīng)激可以破壞CS暴露誘導(dǎo)的再鞏固過程［6］。我們發(fā)現(xiàn)在UCS暴露誘導(dǎo)的再鞏固過程中，給予冰水應(yīng)激可以有效地抑制條件性恐懼記憶在不同條件下出現(xiàn)的復(fù)燃現(xiàn)象，并且應(yīng)激對于UCS誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶的破壞作用至少可以持續(xù)14天，與應(yīng)激對CS誘導(dǎo)記憶再鞏固過程的作用一致。糖皮質(zhì)激素會影響β-腎上腺素受體介導(dǎo)的腺苷3，5-環(huán)磷酸腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和cAMP依賴性蛋白激酶（protein kinase，PKA）的形成，從而影響cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活［12］。記憶被激活之后進(jìn)入再鞏固階段依賴cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性［13，14］。此外，β-腎上腺素受體拮抗劑普萘洛爾被用來干預(yù)條件性恐懼記憶以降低PTSD患者的創(chuàng)傷性體驗的重現(xiàn)［15］。因此，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激對UCS誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶再鞏固過程的破壞作用可能與β-腎上腺素受體-cAMP/PKA系統(tǒng)有關(guān)。

本研究首次證實了應(yīng)激破壞UCS暴露誘導(dǎo)的CFC記憶再鞏固過程，有效地抑制了小鼠的恐懼反應(yīng)在點燃和自發(fā)恢復(fù)條件下的復(fù)燃，但是其確切的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。應(yīng)激作為一種非侵入性和非藥理學(xué)的干預(yù)手段，避免了破壞條件性恐懼記憶過程使用藥理學(xué)干預(yù)手段如使用工具藥物等所帶來的毒副作用對臨床應(yīng)用的限制，可能成為有前景的治療PTSD的新手段。