瞿利花，陳陽曄，李 懿，何 煒，張 冉，申 麗

（1.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410013；2. 中南大學湘雅三醫(yī)院，長沙 410013）

急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）由內、外因素，嚴重的感染、休克、創(chuàng)傷和誤吸等誘因引起，臨床表現(xiàn)為呼吸困難和低氧血癥［1］。ALI特征為肺泡-毛細血管破壞，大量炎性細胞浸潤，促炎因子和細胞毒性介質釋放。ALI最終發(fā)展成呼吸衰竭和全身多器官功能衰竭而致死亡［2］。ALI 的死亡率為 40%-50%［3］。ALI 的早期治療對預防疾病的惡化非常重要。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）又名內毒素，它能誘導機體感染，已被廣泛應用于研究 ALI 的模型中［4］。目前臨床上常用的治療 ALI 的藥物大多為抗生素和糖皮質激素類，易產生耐藥性和副作用大等問題，因此有效的藥物，對于預防和治療 ALI十分必要。

甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）是甘草中的主要活性成分之一，是一種五環(huán)三萜系列皂苷，五環(huán)三萜結構具有抗感染和抗病毒等作用且不良反應少［5-6］。臨床上通常把甘草制劑用來治療病毒性肝炎等［7］，而它在預防和治療 ALI 方面的應用很少。因此，研究 GA 在 ALI中的保護機制，可以為甘草這種物美價廉的中草藥，在急性肺損傷疾病的推廣應用中奠定基礎。

血管緊張素轉換酶-2（Angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是血管緊張素轉換酶（ACE）的同工酶，在2000 年被單獨克隆出來［8］。ACE2 可以切割 Ang I以產生無活性的 Ang-（1-9）肽，然后 ACE 或中性內肽酶（NEP）將其轉化為血管舒張肽 Ang-（1-7），它能拮抗血管緊張素 II（Ang-II）引起的細胞損傷［9］。Ang-II 在ALI 過程中能引起炎癥反應，它能被ACE2 降解。ACE2的缺失，導致由 Ang II 誘導的炎性細胞在主動脈的表達顯著增加，加重血管炎癥［10］。然而，GA 是否可以通過調節(jié)ACE2 來影響 ALI 的進展尚無報道。本研究旨在探討 GA 對 LPS 誘導的 ALI 模型的保護并初步闡明GA 發(fā)揮作用的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑甘草酸購自上海TCI 化成發(fā)展有限公司；LPS購自美國 Sigma 公司；ACE2多克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；IHRP 標記山羊抗兔 IgG購自武漢塞維爾生物公司。

1.2 實驗動物分組60 只小鼠隨機分 4 組：（1）對照組（Ctrl 組）；（2）GA 組 ：GA（200 mg/kg）；（3）LPS 組 ：LPS（10 mg/kg）；（4）GA+LPS 組 ：GA（200 mg/kg）1 h 后 LPS 給藥（10 mg/kg），所有的藥物都是腹腔注射。8 h 后取肺組織并稱量肺濕重（g），樣本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 肺系數(shù)肺系數(shù)=（肺濕重體重比，Lung Coefficient）：是一項動物實驗的測量指標，通常用來評估肺水腫程度，肺濕重（g）/體重（kg）×100%。取出小鼠全肺后，剔除多余組織、去除血跡，稱重（g），計算肺系數(shù)。

1.4 HE染色和免疫組化肺組織切片HE 染色，按照常規(guī)烤片-脫蠟-至水-染色-脫水-透明-封片進行。 肺組織免疫組化經石蠟切片脫蠟后用EDTA進行抗原修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。用BSA封閉2 h后，滴加稀釋好的一抗，4℃過夜。滴加二抗，室溫孵育1 h，滴加DAB顯色液，蘇木素復染細胞核1 min，脫水封片，顯微鏡觀察。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達肺組織蛋白SDS-PAGE凝膠電泳；蛋白條帶轉移到甲醇浸泡活化后的PVDF膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉 1 h；加入一抗4℃冰箱孵育15～18 h；PBS洗滌后常溫孵育二抗 1 h；用ECL化學發(fā)光顯色液，顯影成像。用Image J測定各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析使用 SPSS 16.0 軟件分析實驗數(shù)據，用 One-way ANOVA 單因素方差分析檢驗，結果以均數(shù)±標準差表示。雙側P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GA對肺組織形態(tài)學的影響LPS處理后小鼠肺系數(shù)明顯升高（P<0.05）；GA給藥后組肺系數(shù)明顯低于LPS組（P<0.05，圖1A）。HE染色結果顯示：Ctrl 組肺泡組織結構完整，肺間質未見炎性細胞。LPS組肺泡結構破壞明顯，肺間質可見大量炎性細胞浸潤。而GA+LPS 組肺間質炎性細胞浸潤明顯減少（圖1B）。

圖1 GA 對肺組織形態(tài)學的影響 A：肺系數(shù)，與Ctrl組相比***P<0.001；與LPS相比##P<0.01；B：小鼠肺組織病理變化（HE×200）。

2.2 GA 對肺組織 ACE2 的影響Western blotting和免疫組織化學結果顯示，與Ctrl組相比，LPS 能下調ACE2的表達（P<0.05）；與LPS組相比，GA 處理后能顯著上調 ACE2 的表達（P<0.05，圖2）。

圖 2 GA 對肺組織 ACE2 的影響 A ：與Ctrl組相比，*P<0.05 ；與LPS相比，#P<0.05 ；B ：肺組織免疫組化ACE2 蛋白的表達（×200）。

3 討論

在 ALI的發(fā)展過程中肺泡－毛細血管破壞，炎性細胞不斷聚集，導致了持續(xù)進展性的肺部炎癥［11-13］。當這些癥狀無法得到有效緩解與控制時，往往發(fā)展為呼吸衰竭最終導致患者死亡。 目前的藥物治療仍舊無法滿足患者的需要，這也是 ALI 死亡率較高的主要原因。因此，尋找影響 ALI 發(fā)生發(fā)展中的特異性靶分子意義重大。

GA能發(fā)揮多種生物學功能。研究表明，GA能夠抑制角叉萊膠誘導的胸膜炎與支氣管肺泡灌洗液中炎性細胞的浸潤［14］；也有研究發(fā)現(xiàn) GA 具有顯著的抗SARS 病毒作用［15］。這些研究提示，GA可能作為一種有效的藥物，用于肺部疾病的治療。我們的實驗研究結果表明，GA 治療后明顯緩解小鼠肺組織水腫和炎性細胞浸潤。由此我們發(fā)現(xiàn)GA 對肺組織具有保護作用，能夠緩解 LPS導致的ALI。

ACE2在ALI中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮 IIA 能夠上調 ACE2 的表達，進而緩解百草枯誘導的ALI［16］。此外，脂氧素 A4 也可通過活化 ACE2-Ang（1-7）-Mas 信號改善 LPS 誘導的 ALI［17］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，GA 能夠緩解 LPS 引起的 ACE2 表達減少，由此提示，GA 對 ALI 的保護作用可能是通過上調 ACE2 來實現(xiàn)的。

本研究通過LPS誘導的ALI的小鼠模型，小鼠肺組織出現(xiàn)明顯肺損傷，肺組織ACE2表達下調；GA處理后減輕肺損傷，肺組織ACE2水平上調，說明GA能明顯減輕LPS誘導的ALI的損傷程度，其機制可能與ACE2 激活有關。然而ALI發(fā)病機制復雜，GA治療ALI的具體作用機制仍需進一步探究。