謝 麗，賴 瓊，孫國瑛，石金鳳，謝遠杰，賀麗萍

（1.長沙市衛(wèi)生職業(yè)學院，長沙 410100；2.湖南師范大學附屬湘東醫(yī)院，醴陵 412200；3.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410006；4.南華大學衡陽醫(yī)學院，衡陽 421001）

近年來，睪丸局部溫度和精子發(fā)生的關(guān)系已受到越來越多國內(nèi)外學者的關(guān)注。隱睪癥及睪丸局部熱處理會導致生精上皮的形態(tài)改變及大量生精細胞凋亡，從而出現(xiàn)少精與無精現(xiàn)象［1，2］，但熱應激造成男性生精障礙的分子機制尚未充分闡明。p38MAPK是MAPK家族中的重要成員，細胞外應激因子如紫外線、細胞外高滲、熱休克、強氧化劑等能導致p38MAPK磷酸化活化，并通過一系列下游信號調(diào)控細胞凋亡，在生精細胞凋亡過程中p38MAPK通路被激活［3］。NO是一種具有生物活性的自由基，它的前體是L-精氨酸，在一氧化氮合酶（NOS）作用下產(chǎn)生NO。研究表明NO是熱激導致生精細胞調(diào)亡的重要信號分子［4］。本實驗通過建立單側(cè)隱睪模型，觀察NOS抑制劑對隱睪生精細胞凋亡以及p38MAPK表達的影響，闡述在熱激導致生精細胞凋亡過程中NO與p38MAPK的關(guān)系，為研究熱壓導致生精細胞凋亡的分子機制提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 隱睪模型的建立與處理48只健康雄性SD大鼠（42 day-old）喂養(yǎng)7天后隨機分為假手術(shù)組、隱睪組、隱睪+NOS抑制劑（L-NAME）組、隱睪+生理鹽水組。隱睪模型的建立：戊巴比妥鈉（30mg/Kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，下腹正中切口，切斷右側(cè)睪丸引帶，用5-0尼龍線將右側(cè)睪丸固定于腹后壁關(guān)腹，假手術(shù)組右側(cè)睪丸切斷引帶后還納入陰囊關(guān)腹。隱睪+L-NAME組與隱睪+生理鹽水組術(shù)后分別于腹腔內(nèi)注射L-NAME或生理鹽水，每天一次，定時定量（50mg/Kg）。術(shù)后第7天處死動物，留取各組大鼠雙側(cè)睪丸稱濕重后立即將各組大鼠右側(cè)睪丸沿長軸方向切開，一半用來進行Western blot、NO含量和NOS活性檢測以及流式細胞術(shù)檢測，另一半均投入4%多聚甲醛固定以進行組織學及原位凋亡檢測。

1.2 主要試劑SD大鼠由湖南農(nóng)業(yè)大學實驗動物部提供，L-NAME與蛋白定量試劑盒購自北京華美公司，兔抗鼠磷酸化p38MAPK IgG 購自基因公司，羊抗兔IgGHRP購自北京中山公司，S-P 免疫組化試劑盒 購自福州邁新公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德公司，NO與 NOS檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。

1.3 主要方法

1.3.1 睪丸組織的NO含量檢測用硝酸還原酶法檢測睪丸組織NO含量。操作按說明書進行如下：將各睪丸組織用4℃預冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分后稱重，取睪丸組織0.2～0.3 g加9倍生理鹽水制備成10%組織勻漿，1000r/min分離心5分鐘后取上清0.5mL，加入試劑1、試劑2各0.2 mL混勻，37℃水浴2小時。再加入蛋白分離劑，混勻，靜置10分鐘，用721分光光度計以0.5cm光徑在550nm波長處測吸光度，再根據(jù)吸光度通過計算得出NO含量。

1.3.2 睪丸組織NOS活性的測定采用化學比色法測定睪丸組織中NOS活性，其原理為NOS催化L-Arg和分子氧反應生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，通過測定吸光度可計算出NOS活力。操作按試劑說明書進行：將各睪丸組織用4℃預冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分后稱重，取大鼠睪丸組織0.2～0.3 g加9倍生理鹽水制備成10%組織勻漿，3000 r/min離心10分鐘后取上清50μL，再依次加入底物緩沖液200μL，促進劑10μL及顯色劑100μL，混勻后37℃水浴反應15分鐘，加入透明劑100μL及終止液2000μL后用721分光光度計以1.0cm光徑在530nm波長處測吸光度，再根據(jù)吸光度通過計算得出NOS活性。

1.3.3 免疫組化SP法檢測p38MAPK蛋白常規(guī)石蠟切片，免疫組織化學SP法嚴格按試劑盒說明書操作，陰性對照以PBS代替一抗，組織中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性反應。應用GSM圖象處理系統(tǒng)計算陽性細胞的平均灰度值。

1.3.4 Western blot檢測p38MAPK蛋白表達量稱取睪丸組織置小燒杯中，用PBS液洗滌2次，加入適量的組織裂解液（100 mM NaCl，10 mM Tris·Cl，1mM EDTA，1ug/mL Aprotinin，100ug/mL PMSF），置于冰上5min，用眼科剪剪碎，倒入5mL勻漿器中，反復抽取勻漿組織，再將其吸入EP管中，離心（4℃ 1000g 10min），吸出上清液，即為組織總蛋白，用BCA法進行蛋白定量。調(diào)節(jié)每份樣品濃度，以等量的蛋白量加樣，樣品加入等體積2×SDS加樣緩沖液，沸水煮沸10min，經(jīng)SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜4h；膜用5%牛奶封閉液（2.5g牛奶＋50mL TBST）封閉2h；加一抗（用1%牛奶封閉液稀釋），37℃孵育2h；TBST洗15 min×3次；加相應的二抗（也用1%封閉液稀釋），37℃孵育1 h，TBST洗15 min×4次；用ECL發(fā)光法檢測不同蛋白表達狀況；薄層掃描儀測定印跡區(qū)帶的光密度值。

1.3.5 流式細胞術(shù)測定生精細胞DNA含量和細胞凋亡每組取6份0.25×0.25cm大小睪丸組織放入置于培養(yǎng)皿上的240目不銹鋼篩網(wǎng)內(nèi)，用眼科組織剪將睪丸組織剪碎，用注射器的針芯輕搓組織塊，邊搓邊滴加生理鹽水，直到組織搓完，收集細胞懸液，離心（1000r/min×8min），然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline solution，PBS）洗滌2次，冰冷的70%乙醇固定，4℃保存。樣本上機前作如下處理：①將乙醇固定的細胞離心洗滌，去上清，搖勻；②加RNA酶50μl（濃度為0.5 g·L-1），37℃水浴 30min。③加碘化丙啶（PI）50μl，濃度為1 g/L，振蕩混勻，避光置冰箱30min；④300目尼龍網(wǎng)濾過，上機檢測。

1.3.6 TUNEL法檢測生精細胞凋亡睪丸組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，脫蠟水化，原位凋亡測定按試劑盒說明書操作。胞核著紫藍色者為陽性細胞，即凋亡細胞。陰性空白對照未加TUNEL反應液。每個睪丸組織切片觀察10個生精小管橫斷面，平均每個生精小管橫斷面的調(diào)亡細胞數(shù)即為凋亡指數(shù)（AI）。

1.4 統(tǒng)計分析計量資料均采用均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對組間均數(shù)進行單因素方差分析，P<0.05認為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 兩側(cè)睪丸大體改變及重量變化術(shù)后第7天，與左側(cè)相比，隱睪組、隱睪+生理鹽水組和隱睪+L-NAME組右側(cè)睪丸的重量均減輕（P<0.001），但隱睪+L-NAME組右側(cè)睪丸較左側(cè)睪丸縮小的程度明顯輕于隱睪組和隱睪+生理鹽水組（P<0.05）。假手術(shù)組睪丸重量雙側(cè)差異無顯著性（見表1）。

表1 術(shù)后第7天雙側(cè)睪丸重量的變化（n=12）

2.2 各組大鼠右側(cè)睪丸內(nèi)NO和NOS活性的變化如表2所示，術(shù)后第7天，隱睪組和隱睪+生理鹽水組大鼠右側(cè)睪丸NO濃度和NOS活性均明顯高于假手術(shù)組和隱睪+L-NAME組（P<0.05），差別均有顯著性意義；隱睪+L-NAME組睪丸組織內(nèi)NO濃度和NOS活性較假手術(shù)組高，差別沒有顯著性意義。

表2 睪丸 NOx- 和NOS 活性的變化（n=12）

2.3 磷酸化p38MAPK表達

2.3.1 免疫組化檢測如圖1所示，免疫組化顯示各組大鼠右側(cè)睪丸間質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮和平滑肌細胞內(nèi)均有表達，但假手術(shù)組睪丸生精上皮未見p-p38MAPK表達，而其他三組的睪丸生精上皮及生精小管管腔內(nèi)均可見到p-p38MAPK免疫陽性細胞，且多見于胞漿和（或）胞核，但隱睪+L-NAME組的p-p38MAPK表達弱于隱睪組和隱睪+生理鹽水組。

圖1 免疫組化檢測磷酸化p38MAPK表達（DAB染色，蘇木素復染，×400）

2.3.2 Western blot檢測如圖2所示，隱睪組和隱睪+生理鹽水組磷酸化p38MAPK蛋白表達量增高，為假手術(shù)組的約2.5倍（P<0.01），為隱睪+L-NAME組的約1.3倍（P<0.05）。而隱睪+SB203580組的則為假手術(shù)組的約1.8倍（P<0.05）。總p38MAPK作為內(nèi)對照，各組表達均無差別（P>0.05）。

2.4 生精細胞凋亡檢測

2.4.1 流式細胞術(shù)如圖3所示，四組大鼠生精細胞在G1期前端均出現(xiàn)了一個稱之為凋亡峰的亞倍體峰。與假手術(shù)組和隱睪+L-NAME組比較，隱睪組和隱睪+生理鹽水組大鼠生精細胞凋亡率明顯增高（見表3）。

圖2 Western blot檢測磷酸化p38MAPK蛋白變化

表3 右側(cè)睪丸生精細胞凋亡率（n=12）

圖3 生精細胞凋亡的流式細胞術(shù)檢測

2.4.2 TUNEL原位末端標記法如圖4所示，四組睪丸內(nèi)均可見到胞核為紫藍色的凋亡的生精細胞，包括初級精母細胞和精原細胞，未見到支持細胞發(fā)生凋亡，隱睪組和隱睪+生理鹽水組睪丸生精小管內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡細胞，隱睪+L-NAME次之，假手術(shù)組最少（見表4）。

表4 右側(cè)睪丸內(nèi)生精細胞凋亡指數(shù)（n=12）

圖4 原位末端標記法生精細胞凋亡情況（×400）

3 討論

睪丸生精小管內(nèi)精子的發(fā)生是一個高度協(xié)調(diào)與相當復雜的過程，正常情況下精子的產(chǎn)生與生精細胞的凋亡同時存在，這對排除異常精子，維持精子數(shù)量與質(zhì)量穩(wěn)態(tài)起著重要作用，而異常增多的生精細胞凋亡可造成弱精與少精從而導致男性不育［5］?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)多種理化因素可導致生精細胞凋亡增加，其中陰囊溫度的局部升高是導致生精細胞過度凋亡的重要原因之一［6］。本研究通過建立隱睪模型，發(fā)現(xiàn)隱睪內(nèi)生精上皮變薄，生精細胞凋亡大量增加，進一步說明熱應激可導致生精細胞凋亡［7］。

熱應激造成生精細胞凋亡的機制目前尚未完全闡明，有研究表明熱壓可導致睪丸組織內(nèi)的活性氧增加，過量的活性氧可以破壞精子中的細胞器引起線粒體內(nèi)的凋亡級聯(lián)反應導致精子失去活力［8］。NO是一種重要的生物活性分子，其供體硝普鈉能促進生精細胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠隱睪NOS活性與NO含量明顯增高，生精細胞凋亡指數(shù)與凋亡率升高，抑制劑L-NAME可抑制NO的產(chǎn)生從而減輕生精細胞凋亡。提示NO介入了熱應激所致的生精細胞凋亡過程。

一氧化氮可通過多種信號通路調(diào)控細胞凋亡［10］，其導致生精細胞凋亡涉及到P53、Bcl-2/Bax等多個凋亡相關(guān)基因［11，12］。本研究前期工作證實實驗性隱睪可激活MAPK通路。在本實驗中，給予適量L-NAME后，隱睪生精上皮的磷酸化p38MAPK蛋白表達下調(diào)，同時生精細胞凋亡指數(shù)下降，表明L-NAME可以通過抑制磷酸化p38MAPK的表達來抑制生精細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，NO誘導的其他類型細胞凋亡過程中也出現(xiàn)了p38MAPK的激活。Jun等［13］研究發(fā)現(xiàn)，將HL-60細胞暴露于硝普鈉能明顯激活p38激酶，且能被SB203580所阻斷，認為p38MAPK在NO誘導的神經(jīng)細胞凋亡中起調(diào)控作用。在NO通過刺激bax流入線粒體而導致神經(jīng)元細胞死亡的過程中，p38MAPK的活化起到關(guān)鍵作用［14］。

本研究結(jié)合文獻資料表明，在隱睪導致的生精細胞凋亡過程中，NOS的表達增加導致NO局部含量升高，NO激活p38MAPK途徑，磷酸化的p38MAPK激活一系列下游信號，最終導致生精細胞細胞凋亡。Ishikawa等研究發(fā)現(xiàn)，在隱睪癥患者中NOS表達上調(diào)，抑制P38絲裂原活化蛋白激酶可使NOS表達下調(diào)［15］，提示在隱睪所致生精細胞凋亡過程中，NOS/NO通路與p38MAPK途徑有相互調(diào)控的作用。有關(guān)NO活化p38MAPK的何種上游分子，以及活化后的p38MAPK調(diào)控哪些下游因子最終導致生精細胞凋亡，尚有待進一步研究。