郭宗華，孔東波，鄒偉

咸寧市中心醫(yī)院湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖北 咸寧 437100

膀胱癌是全球第二大常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，是泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤患者的常見死亡原因，在2015年導(dǎo)致約18萬人死亡[1]。研究表明，盡管膀胱癌的5年生存率為77%，但根據(jù)膀胱癌的類型和分期而有所不同。當(dāng)腫瘤為浸潤性但未擴(kuò)散到膀胱外時(shí)，其5年生存率仍為70%，但如果腫瘤細(xì)胞遷移到周圍組織（如前哨淋巴結(jié)和器官）并擴(kuò)散到遠(yuǎn)處器官，則5年生存率分別下降至35%和＜10%。所以，早期發(fā)現(xiàn)沒有近處和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的膀胱癌對于提高膀胱癌患者的生存率至關(guān)重要[2]。因此，迫切需要鑒定生物標(biāo)志物以為膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、病情監(jiān)測提供更多依據(jù)。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性表達(dá)的約22個(gè)核苷酸長的小非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA參與廣泛的生理過程，包括細(xì)胞周期、增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡[3]。最近，越來越多的證據(jù)表明，miRNA可以根據(jù)其靶miRNA的功能發(fā)揮抑癌或致癌的作用[4]。更重要的是，miRNA的異常表達(dá)可以作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。在10例年齡、性別和吸煙狀況相匹配的非肌肉浸潤性膀胱癌病例和相應(yīng)健康對照人群中對血清miRNA進(jìn)行的高通量篩選中發(fā)現(xiàn)，miRNA-342的高表達(dá)與膀胱癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著降低有關(guān)。在隨后的大樣本研究中，miRNA-342高表達(dá)的膀胱癌患者年齡普遍偏低、惡性程度偏高[5]，而在肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌中miRNA-342則發(fā)揮抑癌作用[6]。這些結(jié)果表明，miRNA-342可能在膀胱癌中起作用但其具體意義還需進(jìn)一步探究。本研究中，檢測了膀胱癌組織和正常膀胱組織之間的miRNA-342表達(dá)差異，并評估了miRNA-342表達(dá)在膀胱癌患者中的臨床意義及與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年11月至2014年12月咸寧市中心醫(yī)院泌尿外科收治的行根治性全膀胱切除術(shù)或膀胱部分切除術(shù)的原發(fā)性膀胱癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)確診為原發(fā)性膀胱癌；術(shù)前未行放化療，且無其他部位原發(fā)性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：不愿或難以配合隨訪；嚴(yán)重營養(yǎng)不良及合并心、肝、腎等主要臟器嚴(yán)重疾??；患精神疾病。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入200例原發(fā)性膀胱癌患者，男121例，女79例；年齡54～76歲，平均（63.0±4.9）歲；T1～2期141例，T3～4期59例；單發(fā)腫瘤101例，多發(fā)腫瘤99例。收集200例患者術(shù)后膀胱癌組織和鄰近的正常膀胱組織。將手術(shù)切除的所有標(biāo)本冷凍并保存在液氮中直至后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

TRIzol?試劑、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（realtime polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑均購自日本Takara公司；miRNA-342及內(nèi)參U6引物設(shè)計(jì)和合成均由上海吉瑪科技生物有限公司完成。酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)和PCR儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集及隨訪 由兩名病理學(xué)醫(yī)師獨(dú)立檢查蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色的組織切片，以確定每個(gè)標(biāo)本的腫瘤分期和組織學(xué)分級。所有患者均收集性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量等臨床資料，其中復(fù)發(fā)定義為膀胱腔內(nèi)出現(xiàn)任何新的腫瘤。所有患者獲取完整隨訪資料，包括地址及聯(lián)系方式，以門診復(fù)查、電話方式對入組患者進(jìn)行隨訪，隨訪至2019年12月，觀察終點(diǎn)為總生存期（overall survival，OS）：確診膀胱癌至最后因癌癥死亡的時(shí)間。

1.3.2 RNA提取及RT-PCR檢測 使用TRIzol?試劑分離組織總RNA，按照說明書進(jìn)行操作。使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)是在Bio-Rad CFX96序列檢測系統(tǒng)上使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG試劑進(jìn)行，以U6作為內(nèi)部對照，引物序列：miRNA-342正義，5'-AAGATGTGGAAAAATTGGAATC-3'，miRNA-342 反 義 ，5'-ATTCTAATTTCTCCACGTCTTT-3'；U6正 義 ，5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，U6反義，5'-GGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。反應(yīng)條件為95℃30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s）×40個(gè)循環(huán)，使用2-△△Ct表示miRNA-342相對表達(dá)量，依據(jù)miRNA-342相對表達(dá)量中位數(shù)5.421將患者分為miRNA-342高表達(dá)組（n=98）和miRNA-342低表達(dá)組（n=102）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Logrank檢驗(yàn)比較生存情況；影響因素的單因素及多因素分析采用Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織及正常膀胱組織中miRNA-342相對表達(dá)量的比較

膀胱癌組織中miRNA-342相對表達(dá)量為（3.42±0.61），明顯低于正常膀胱組織中的（7.31±1.21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.71，P=0.000）。

2.2 不同臨床特征膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達(dá)情況的比較

不同腫瘤分期及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤大小和腫瘤數(shù)量膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

2.3miRNA-342高表達(dá)與低表達(dá)膀胱癌患者生存情況的比較

miRNA-342高表達(dá)患者中位總生存時(shí)間為51.2個(gè)月，1年、3年、5年生存率分別為93.8%、79.5%、35.7%，miRNA-342低表達(dá)患者中位生存時(shí)間為36.1個(gè)月，1年、3年、5年生存率分別為78.4%、51.9%、17.6%，miRNA-342高表達(dá)患者的生存情況明顯優(yōu)于miRNA-342低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.549，P=0.003）。（圖1）

2.4 膀胱癌患者預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析

以Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析。單因素分析表明，腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和miRNA-342表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）（表2）。多因素分析表明，腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、miRNA-342表達(dá)均是膀胱癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（表3）。

表1 不同臨床特征膀胱癌患者的膀胱癌組織中miRNA-342表達(dá)情況的比較（n=200）

圖1 miRNA-342高表達(dá)（n=98）與低表達(dá)（n=102）膀胱癌患者的生存曲線

表2 膀胱癌患者預(yù)后影響因素的單因素分析

表3 膀胱癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

3 討論

作為泌尿系統(tǒng)的常見惡性腫瘤之一，約40%的膀胱癌患者會經(jīng)歷多次復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。由于目前沒有可靠的診斷性生物標(biāo)志物可用于早期膀胱癌的檢測，造成了早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌非常困難。復(fù)發(fā)與膀胱癌的分期有關(guān)，因此迫切需要具有高靈敏度和特異度的新型生物標(biāo)志物作為膀胱癌的診斷和預(yù)后工具[7]。

異常的miRNA表達(dá)是癌癥發(fā)展過程中的一個(gè)常見且重要的特征。越來越多的研究表明，miRNA調(diào)節(jié)包括膀胱癌在內(nèi)的各種類型惡性腫瘤中許多與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)[8]。例如，miRNA-29c可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。miRNA-124-3p過表達(dá)顯著抑制了膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[9]。另一項(xiàng)研究表明，miRNA-155通過抑制腫瘤抑制物周期素D相互作用蛋白1充當(dāng)膀胱癌的腫瘤啟動子[10]。這些結(jié)果表明，miRNA在膀胱癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。目前也有研究證明了miRNA作為膀胱癌預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在作用。例如，膀胱癌標(biāo)本中miRNA-148a表達(dá)降低，而miRNA-148a表達(dá)降低與較短的生存時(shí)間有關(guān)[11]，miRNA-34a的下調(diào)與膀胱癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)[12]。

在實(shí)體腫瘤中，miRNA-342被鑒定為腫瘤抑制因子。例如，miRNA-342通過抑制肺癌中的叉頭蛋白 M1（forkhead box protein M1，F(xiàn)OXM1）抑制肺癌細(xì)胞增殖[13]，miRNA-342靶向前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）抑制子宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[14]。Ma等[15]報(bào)道m(xù)iRNA-342通過直接抑制人肺癌中的轉(zhuǎn)錄因子E2F調(diào)節(jié)MYC轉(zhuǎn)錄活性。在肝癌中，miRNA-342通過調(diào)節(jié)核因子κB途徑影響細(xì)胞增殖[16]。在膀胱癌患者血清miRNA高通量篩選中發(fā)現(xiàn)，miRNA-342被認(rèn)為對膀胱癌的發(fā)生起到抑制作用，但miRNA-342高表達(dá)的膀胱癌患者發(fā)生年齡普遍偏低[5]，這一結(jié)果說明miRNA-342參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，但miRNA-342是否會影響膀胱癌患者的預(yù)后仍不明確。本研究首先檢測了膀胱癌組織和相應(yīng)正常膀胱組織中miRNA-342的表達(dá)，并顯示miRNA-342在膀胱癌組織中表達(dá)降低。然后，本研究觀察到miRNA-342表達(dá)降低與臨床晚期、復(fù)發(fā)和有關(guān)，這表明miRNA-342表達(dá)降低可能促進(jìn)膀胱癌的侵襲性表型。此外，本研究評估了miRNA-342在膀胱癌預(yù)后監(jiān)測中的作用，發(fā)現(xiàn)miRNA-342表達(dá)水平較低的患者總生存時(shí)間比miRNA-342表達(dá)水平較高的患者短，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型的單因素和多因素分析進(jìn)一步支持了這些發(fā)現(xiàn)，表明miRNA-342是膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

綜上所述，miRNA-342表達(dá)在膀胱癌組織中明顯降低，膀胱癌組織中較低水平的miRNA-342與患者總生存時(shí)間縮短有關(guān)。miRNA-342是膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后因素，可作為膀胱癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。