羅樂，楊陳武，敬巧，杜成超，文愛平#

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1醫(yī)學(xué)影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2婦產(chǎn)科，四川 南充 637000

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，好發(fā)于55～65歲女性，具有發(fā)病隱匿、惡性程度高和侵襲力強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。近年來，雖然卵巢癌的治療水平有所提高，但EOC患者的5年生存率仍約為30%，是婦科惡性腫瘤的首要病死原因[2]。探索EOC病理過程中的關(guān)鍵因子對尋找新的治療靶點(diǎn)和改善患者的預(yù)后具有重要意義。Tip60蛋白屬于MYST家族成員，能夠介導(dǎo)核心組蛋白的乙?；?、分子磷酸化和泛素化，通過對細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)和細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，從而負(fù)性調(diào)控腫瘤的發(fā)生。Tip60蛋白在調(diào)控基因表達(dá)、修復(fù)DNA損傷、重建染色質(zhì)等領(lǐng)域成為當(dāng)前分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)，其低表達(dá)是導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[5]。然而，Tip60蛋白的表達(dá)與EOC患者的臨床特征及預(yù)后的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測EOC組織中Tip60蛋白的表達(dá)情況，分析Tip60蛋白的表達(dá)與EOC患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，為EOC的臨床治療和預(yù)后預(yù)測提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2013年1月至2014年1月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院82例EOC患者的石蠟組織標(biāo)本，患者均為初診、初治的卵巢癌患者，術(shù)前未接受過放療、化療等治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診。EOC患者的年齡為41～73歲，平均年齡為（59.26±6.31）歲；組織類型：低級別漿液性癌31例，高級別漿液性癌18例，黏液性腺癌21例，子宮內(nèi)膜腺癌12例；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。選取37例卵巢良性病變患者的卵巢良性病變組織標(biāo)本，患者的年齡為40～72歲，平均年齡為（58.72±6.29）歲；疾病類型：巧克力囊腫19例，單純卵巢囊腫10例，黃體囊腫8例。另收集31例非卵巢疾病患者的健康卵巢組織標(biāo)本作為對照，患者的年齡為45～73歲，平均年齡為（59.53±6.17）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

采用En-vision法檢測各卵巢組織標(biāo)本中Tip60蛋白的表達(dá)情況，將標(biāo)本切片后脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗5 min，洗滌3次，使用3%過氧化氫于室溫孵育15 min，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。使用蒸餾水沖洗，再用PBS洗滌5 min，洗滌3次；滴加兔抗人Tip60多抗（一抗，稀釋比例為 1∶150），室溫孵育 30 min，然后PBS漂洗5 min，3次；加ChemMate Envision+/HRP工作液，室溫孵育30 min，PBS漂洗5 min，3次；滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，室溫孵育10 min，顯色完全后終止顯色。采用蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水，二甲苯漂洗3次，封片膠封片。采用試劑盒內(nèi)的陽性標(biāo)準(zhǔn)物作為陽性對照，以PBS溶液代替一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，根據(jù)染色程度評分：無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕黑色計(jì)3分；依據(jù)陽性細(xì)胞比例評分：0～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分。Tip60蛋白染色的最終評分為染色程度和陽性細(xì)胞比例的乘積，＜8分為低表達(dá)，≥8分為高表達(dá)。

1.4 治療方案及隨訪

根據(jù)具體病情選擇適當(dāng)?shù)氖中g(shù)方案，包括全子宮及雙附件、轉(zhuǎn)移瘤、大網(wǎng)膜及闌尾切除術(shù)和盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)等。術(shù)后1周給予紫杉醇聯(lián)合卡鉑化療，每3周為1個(gè)療程，共化療6個(gè)療程。對所有患者手術(shù)后每3個(gè)月通過電話或門診隨訪1次，記錄患者的5年生存情況，隨訪截至術(shù)后5年或患者死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；構(gòu)建Cox回歸模型對卵巢癌患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tip60蛋白在不同卵巢組織中的表達(dá)情況

EOC組織中Tip60蛋白的高表達(dá)率低于良性卵巢病變組織和健康卵巢組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；良性卵巢病變組織和健康卵巢組織中Tip60蛋白的的高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。EOC組織、良性卵巢病變組織和健康卵巢組織中Tip60蛋白的的高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.299，P＜0.01）。（表1）

2.2 Tip60蛋白表達(dá)與EOC患者臨床特征的關(guān)系

不同年齡、組織類型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和合并腹腔積液情況的EOC患者EOC組織中Tip60蛋白的高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；組織學(xué)分級為G1～2級的EOC患者EOC組織中Tip60蛋白的高表達(dá)率高于組織學(xué)分級為G3級的EOC患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

2.3 Tip60蛋白的表達(dá)對卵巢癌患者生存時(shí)間的影響

82例EOC患者均完成最終隨訪，平均生存時(shí)間為（36.32±1.88）個(gè)月。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tip60低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間為28.00個(gè)月，短于Tip60高表達(dá)患者的44.00個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.093，P＜0.05）。Tip60低表達(dá)患者的5年生存率為19.05%（12/63），明顯低于Tip60高表達(dá)患者的42.11%（8/19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.208，P＜0.01）。

2.4 卵巢癌患者生存影響因素的單因素分析

截至隨訪結(jié)束，82例卵巢癌患者中，生存20例，病死62例，卵巢癌患者的術(shù)后5年生存率為24.39%（20/82）。不同年齡、組織類型、FIGO分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否存在腹腔積液和Tip60蛋白表達(dá)情況的卵巢癌患者的5年生存情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 卵巢癌患者5年生存情況影響因素的單因素分析（n=82）

2.5 卵巢癌患者生存影響因素的多因素分析

將單因素分析結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)一步納入Cox模型，多因素分析結(jié)果顯示：FIGO分期高、組織學(xué)分級高和存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是EOC患者5年生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），Tip60高表達(dá)是EOC患者5年生存率的保護(hù)因素（P＜0.05）。（表4）

3 討論

卵巢惡性腫瘤為女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌，病死率位居首位[6-7]。EOC是卵巢惡性腫瘤的常見類型，占所有卵巢惡性腫瘤的86%～90%[8]，具有惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、術(shù)后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅女性健康。EOC的早期癥狀不明顯，多數(shù)患者就診時(shí)病情已發(fā)展至晚期，錯失了最佳的治療時(shí)機(jī)[9-10]。目前，卵巢癌的治療方式包括手術(shù)和放化療，其中，單純手術(shù)治療很難根治，而多數(shù)患者容易對放化療產(chǎn)生耐受性，導(dǎo)致3年生存率僅為30%左右[11]。因此，尋找影響EOC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子有助于提高治療效果和改善預(yù)后。

乙?；癁檎婧思?xì)胞中蛋白質(zhì)最常見的修飾方式，乙?；揎棇Φ鞍酌富钚浴⒎€(wěn)定性以及DNA結(jié)合力等具有顯著影響[12]。Tip60蛋白是最早采用酵母雙雜交方式確定的、能夠與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）調(diào)節(jié)因子反式轉(zhuǎn)錄激活因子（trans-activator of transcription，TAT）結(jié)合的蛋白，相對分子量為60 kD[13]，能夠介導(dǎo)P53、核心組蛋白等的乙?；揎?，通過不同蛋白間的相互作用參與多條信號通路的活化，從而在細(xì)胞凋亡、基因調(diào)控以及染色體重建等過程中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床分期和組織分化程度有關(guān)，且低表達(dá)的Tip60蛋白會提高結(jié)直腸癌患者對絲裂霉素、奧沙利鉑等化療藥物的敏感性[14]。有報(bào)道稱，Tip60主要通過核因子-Myc和核因子-κB兩條信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15-16]。一方面，Tip60通過GAS41與核因子-Myc結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物，調(diào)控下游基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[17]；另一方面，Tip60能阻斷核因子-κB信號通路，下調(diào)細(xì)胞膜上基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞的黏附性，抑制腫瘤的侵襲[18]。本研究結(jié)果顯示，EOC組織中Tip60蛋白的表達(dá)明顯低于良性卵巢病變組織和健康卵巢組織，且Tip60蛋白的表達(dá)情況與EOC患者的組織學(xué)分級有關(guān)。進(jìn)一步探討Tip60蛋白與EOC患者生存時(shí)間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Tip60蛋白低表達(dá)患者的5年生存率低于Tip60高表達(dá)患者，且Tip60低表達(dá)患者的中位生存時(shí)間也相對較短，提示Tip60蛋白的表達(dá)水平與EOC患者的預(yù)后有關(guān)，Tip60可作為評估患者預(yù)后的參考指標(biāo)。本研究采用Cox回歸模型分析EOC患者預(yù)后的影響因素，結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期高、組織學(xué)分級高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是EOC患者5年生存狀況的重要危險(xiǎn)因素，而Tip60蛋白高表達(dá)是EOC患者5年生存狀況的保護(hù)因素。

綜上所述，EOC組織中Tip60蛋白的表達(dá)水平降低，且Tip60蛋白的表達(dá)與EOC患者的組織學(xué)分級有關(guān)，檢測Tip60蛋白的表達(dá)情況有助于預(yù)測EOC患者的預(yù)后情況。然而，Tip60在EOC發(fā)生過程中的作用機(jī)制尚不明確，今后應(yīng)深入研究，以期為EOC的臨床治療和改善患者預(yù)后提供依據(jù)。