周波文，王 鑫，王俊衡，潘德樹，繆嗣延，陳張偉，邢 越，胡 琦，楊粵軍

（1.湖南師范大學(xué)樹達(dá)學(xué)院，長沙 410013；2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

輸卵管炎是婦科的常見病。隨著輸卵管炎性阻塞發(fā)病的增加，其主要并發(fā)癥"不孕"導(dǎo)致家庭和社會問題隨之增多，大鼠輸卵管炎癥模型作為研究女性不孕癥狀治療的重要載體，還可作為研究大鼠輸卵管炎癥病理生理機(jī)制的模型。根據(jù)國內(nèi)外研究動態(tài)［1-8］，輸卵管炎病理機(jī)制及治療手段一直是各研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。因此，經(jīng)大鼠陰道注菌法操作，用塑膠巴氏滴管吸取混合菌，從陰道-子宮-子宮底注射細(xì)菌，此操作方便簡便。用此方法建立一個穩(wěn)定的輸卵管炎動物模型對于治療該疾病以及在今后的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用上具有重大的意義。趙廣興大鼠混合菌株接種法［9］：腹腔注射麻醉，打開腹腔，于子宮靠近輸卵管處向兩側(cè)輸卵管分別注入混合菌液，逐層縫合，關(guān)腹。此操作難度大，無菌環(huán)境條件要求高，并容易引起并發(fā)感染。所以大鼠陰道注菌法操作更加簡便，且能建立一種穩(wěn)定可靠的大鼠輸卵管炎模型，并貼近臨床病理模型。

1 材料與方法

1.1 混合細(xì)菌混合細(xì)菌（大腸埃細(xì)菌：腸球菌：白色假絲酵母菌按2：1：1用無菌生理鹽水混合配成3×109cfu/mL）。

1.2 材料

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物SPF級7周齡SD雌大鼠60只，體重（185±15）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供（許可證號：SCXK（湘）2016-0002）。大鼠進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠5只，由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房飼養(yǎng)（許可證號：SYXK（湘）2019-0008）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)器材使用塑膠巴氏滴管（海門市遠(yuǎn)博實(shí)驗(yàn)器材，中國）、混合菌種、固體瓊脂培養(yǎng)基、恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜等（由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 注菌操作實(shí)驗(yàn)組10只大鼠進(jìn)行外陰道注菌法處理：將SD雌大鼠倒立，暴露外陰，用碘伏消毒外陰，用塑膠巴氏滴管吸取0.1mL混合菌液，從外陰道插入，直至子宮底后注射菌液，為了防止菌液逸出，保持倒立3min左右，讓混合菌液流入輸卵管。對照組不做任何處理。

1.3.2 模型檢測分別在實(shí)驗(yàn)開始后第5、10、15、20天隨機(jī)選擇實(shí)驗(yàn)組兩只大鼠進(jìn)行取組織觀察輸卵管的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，并拍照記錄。用剪刀剪開輸卵管的一側(cè)，用無菌羊肉湯濕潤的醫(yī)用棉簽在剪開的輸卵管處刮取輸卵管黏液，并在輸卵管各個部分都分別進(jìn)行刮取。將刮取后的棉簽及時送進(jìn)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，用棉簽走“Z”字形，將刮取的黏液涂滿固體瓊脂培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。

1.3.3 病理檢測將輸卵管制作成切片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。HE染色步驟如下：固定：福爾馬林浸泡2h。脫水：75%酒精1.5h、80%酒精1.5h、90%酒精1h。透明：無水酒精1h、無水酒精1h、無水酒精0.75h、松節(jié)油Ⅰ、Ⅱ都為0.75h。脫蠟：二甲苯10min、無水酒精10min、95%酒精10min、85%酒精10min、75%酒精10min、蒸餾水10min、自來水洗片5min。染色：蘇木素染色2min、自來水洗片5min、鹽酸分化液1s、自來水洗片5min、返藍(lán)液30min、伊紅5min、自來水洗片5min。脫水、透明、封片：蒸餾水3min、75%酒精3min、85%酒精3min、95%酒精3min、無水酒精3min、二甲苯3min、中性樹膠封片。

1.4 主要觀察指標(biāo)（1）對比實(shí)驗(yàn)不同階段大鼠輸卵管形態(tài)；（2）蘇木素-伊紅染色結(jié)果；（3）輸卵管黏膜分泌物細(xì)菌培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)觀察分析每組輸卵管通過肉眼觀察，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組輸卵管的形態(tài)。不同組輸卵管形態(tài)對比見表1。

表1 不同組輸卵管解剖組織形態(tài)比較

2.2 顯微鏡下SD大鼠輸卵管病理切片觀察病理組織學(xué)變化分析：注射細(xì)菌后第5天，輸卵管的粘膜層有大量炎細(xì)胞浸潤，可見炎細(xì)胞浸潤黏膜全層，有向肌層浸潤的趨勢，肌層未累及。注射細(xì)菌后第10天，黏膜層浸潤的炎細(xì)胞開始集中于黏膜層和肌層的交界處，呈長條狀彌散分布，并可見有少量炎細(xì)胞浸潤肌層，平滑肌細(xì)胞間可見單個或多個炎細(xì)胞浸潤。但漿膜層未累及。注射細(xì)菌后第15天，炎細(xì)胞仍浸潤粘膜層全層，并且浸潤肌層炎細(xì)胞增多，呈長條狀分布于平滑肌細(xì)胞間。仍未累及漿膜層。注菌后第20天，炎細(xì)胞已經(jīng)可以在黏膜層、肌層、漿膜層發(fā)現(xiàn)，平且呈彌散，長條狀分布，數(shù)量多。對照組粘膜層、肌層、漿膜層均未見明顯的炎細(xì)胞浸潤，組織結(jié)構(gòu)清楚，結(jié)果見圖1。

圖1 顯微鏡下SD大鼠輸卵管病理切片（×400，HE染色）

2.3 黏液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果對照組：因SD大鼠陰道內(nèi)存在正常菌群，培養(yǎng)基也可見大小不等小菌落，多接近圓形，表面光滑，隆起，黃色，整個培養(yǎng)基透明。實(shí)驗(yàn)組注菌后第十五天細(xì)菌培養(yǎng)出現(xiàn)大小不等的小菌落和較大菌落，小菌落顏色為黃色，隆起，濕潤，菌種較實(shí)驗(yàn)組數(shù)量明顯增多。整個培養(yǎng)基不透明，分布更加致密。

3 討論

輸卵管炎作為一種常見婦科疾病，可造成輸卵管壁粘連阻塞，進(jìn)而導(dǎo)致不孕癥，因此建立一個穩(wěn)定的輸卵管炎動物模型對于治療該疾病以及在今后的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用上具有重大的意義。傳統(tǒng)的建立輸卵管炎模型的方法，如趙廣興等學(xué)者的“混合菌株接種法”［9-12］：打開腹腔，沿子宮找輸卵管，再沿著輸卵管-卵巢方向注射混合菌液造成大鼠輸卵管炎癥。該造模方法沿用至今，但是該方法對動物的損傷較大，暴露腹腔會造成其他炎癥感染或手術(shù)并發(fā)癥，出現(xiàn)動物死亡，影響造模率，并且對實(shí)驗(yàn)無菌環(huán)境要求嚴(yán)格。

趙廣興等學(xué)者［9-12］選用的混合菌液（大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，溶血性鏈球菌=2：1：1）用無菌生理鹽水配成濃度約為3×109cfu/mL。 在注菌一周內(nèi)有部分大鼠因急性感染死亡。其余大鼠輸卵管出現(xiàn)與周圍組織黏連，個別出現(xiàn)積水或積膿。胡喜嬌等［13］使用的是金黃色葡萄球菌用生理鹽水配成濃度為4×109cfu/mL的致病菌懸液。注菌后出現(xiàn)了大鼠輸卵管的積水積膿，注菌時間越長，不僅是輸卵管及卵巢包膜內(nèi)積水積膿，盆腔粘連，而且腹腔各器官形態(tài)也發(fā)生嚴(yán)重變形。本次實(shí)驗(yàn)使用的混合菌液（大腸埃希菌，腸球菌［14］，白色假絲酵母菌［15］=2：1：1混合配成濃度約為3×109cfu/mL）在注菌后發(fā)現(xiàn)大鼠輸卵管出現(xiàn)了水腫，彈性變差，管徑大小不一。沒有出現(xiàn)積水積膿及組織黏連，但在病理圖上有明顯的炎細(xì)胞浸潤。此方法沒有造成實(shí)驗(yàn)動物急性死亡，且更貼近臨床常見感染炎癥的途徑［16］，為以后研究人類輸卵管炎提供了可靠的病理模型。

李楠、劉麗教授對陰道介入法與開腹接種法進(jìn)行了對比研究［17］參考可得，陰道介入法可以一定程度評價(jià)輸卵管炎模型，但效果不如傳統(tǒng)造模，這是由于子宮輸卵管開口處細(xì)胞組織具有先天免疫功能，可有效阻止病原體逆行感染，是人為不可控的干擾因素，這也是本次造模方法均沒有出現(xiàn)組織粘連，膿液滲出的現(xiàn)象，但此造模方法更貼近臨床常見病理模型。

本次實(shí)驗(yàn)方法是用巴氏吸管吸取菌液從大鼠的陰道注入大鼠體內(nèi)，本方案沒有開腹等復(fù)雜操作，避免了一些不確定因素，即陰道注射法比傳統(tǒng)造模方法更加省時省力，技術(shù)難度低，更易操作，也不會引起對實(shí)驗(yàn)無關(guān)的并發(fā)感染，且建模效果佳。

大鼠混合菌陰道接建立輸卵管炎模型的炎癥程度不及傳統(tǒng)造模方法明顯，但此方法操作簡單方便，模型更加穩(wěn)定可靠，貼近臨床病理所見。