萬(wàn)新星，陳漢春

（1. 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院內(nèi)分泌科，長(zhǎng)沙 410013；2. 中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物系，長(zhǎng)沙 410013）

ISG15干擾素刺激基因15（Interferon stimulated gene 15）的表達(dá)產(chǎn)物能被干擾素（interferon，IFN）誘導(dǎo)并大量表達(dá)。ISG15在其激活酶、轉(zhuǎn)移酶和連接酶的協(xié)助下，通過(guò)靶向修飾蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。因其結(jié)構(gòu)和功能與泛素十分類(lèi)似，又被稱為類(lèi)泛素蛋白質(zhì)［1］。ISG15具有很強(qiáng)的抗病毒能力，能抑制乙型流感病毒、埃博拉病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒等多種病毒復(fù)制或釋放，是抑制病毒的關(guān)鍵因子［2-4］。ISG15與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在肺癌、前列腺癌等許多惡性腫瘤中高表達(dá)，能通過(guò)多條通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生，但其機(jī)制尚未清楚［5-8］。前期研究發(fā)現(xiàn)白血病K562細(xì)胞在IFN-α聯(lián)合作用下增殖受抑，且蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IFN-α誘導(dǎo)后的K562細(xì)胞ISG15增加，在干擾素誘導(dǎo)后的白血病KT1-A3細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)ISG15蛋白增加并伴有明顯凋亡；全反式維甲酸RA也能誘導(dǎo)ISG15，并且在臨床上能有效緩解白血病癥狀。為研究ISG15在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的功能，我們?cè)噲D構(gòu)建PCDNA3.1（+）-ISG15載體，以期進(jìn)一步研究ISG15在腫瘤調(diào)控過(guò)程中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)KT1/A3細(xì)胞復(fù)蘇后置于5 mL含有10%胎牛血清（杭州四季青有限責(zé)任公司）、100 U/mL雙抗（青霉素及鏈霉素）的RPMI-1640（美國(guó)GIBCO公司）培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況每2～3天繼續(xù)傳代。

1.2 PCDNA3.1（+）-ISG15載體構(gòu)建KT1/A3細(xì)胞加入1000 U/mL IFN-α（美國(guó)Sigma公司），培養(yǎng)48 h后在無(wú)菌操作臺(tái)中TRIZOL法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)的ISG15上游引物isg15-F1及下游引物isg15-R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增（詳細(xì)序列見(jiàn)表1）。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化后，與空載體PCDNA3.1（+）進(jìn)行KpnI、BamHI（美國(guó)life公司）雙酶切。再次純化后通過(guò)T4連接酶于16℃ 2 h后4℃過(guò)夜連接。連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，吸取轉(zhuǎn)化后的DH5α菌液小心滴在有Amp抗性的LB平板上，均勻涂抹后置于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，觀察是否有菌落長(zhǎng)出，并在超凈臺(tái)中用接種環(huán)挑取單克隆菌落進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 本研究使用的ISG15擴(kuò)增上游引物及下游引物序列

1.3 PCDNA3.1（+）-ISG15載體鑒定平板上單克隆菌落用接種環(huán)小心挑取后，在超凈臺(tái)中小心接種于含60 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩過(guò)夜，待LB培養(yǎng)基渾濁后停止培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。所提取質(zhì)粒經(jīng)KpnI、BamHI雙酶酶切后進(jìn)行瓊脂糖電泳，將目的大小片段切膠回收后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 人源細(xì)胞總RNA提取白血病細(xì)胞株KT1/A3細(xì)胞經(jīng)不同處理后分別培養(yǎng)48 h，Trizol法提取總RNA，點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠，100 V電泳45 min后將凝膠取出并拍照，凝膠成像系統(tǒng)中可見(jiàn)三條清晰的rRNA帶：28S、18S和5.8S+5S（圖1），其中28 S：18 S約為2：1。

圖1 KT1/A3細(xì)胞總RNA提取

2.2 RT-PCR擴(kuò)增isg15基因逆轉(zhuǎn)錄IFN-α處理組的細(xì)胞總RNA，用isg15特異性引物PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠，100 V電泳后檢測(cè)isg15基因片段。凝膠成像系統(tǒng)拍照可見(jiàn)600 bp處有單一明亮isg15條帶（圖2）。

2.3 穿梭載體PCDNA3.1（+）-ISG15構(gòu)建利用KpnI及BamHI 雙酶切PCDNA3.1（+）質(zhì)粒及isg15基因片段，將雙酶切產(chǎn)物按照摩爾比1：10的比例混合，通過(guò)連接、轉(zhuǎn)化、單克隆菌落挑取等實(shí)驗(yàn)成功獲得PCDNA3.1（+）-ISG15穿梭載體。將所得穿梭載體與對(duì)照空載體PCDNA3.1（+）再次用KpnI、BamHI進(jìn)行雙酶切，其產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。圖3初步確認(rèn)穿梭載體PCDNA3.1（+）-ISG15構(gòu)建成功，但仍需進(jìn)一步基因測(cè)序驗(yàn)證。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增isg15基因

圖 3 穿梭載體的雙酶切

2.4 穿梭載體PCDNA3.1（+）-ISG15測(cè)序?qū)⑺肞CDNA3.1（+）-ISG15穿梭載體進(jìn)行基因測(cè)序，結(jié)果如圖4所示：其中黃色標(biāo)記為起始密碼子ATG與終止密碼子TAA。利用BLAST比對(duì)測(cè)序所得序列，發(fā)現(xiàn)序列中有一處同義突變（方框處），編碼框中堿基序列由GTA突變?yōu)镚TG，因鑒定后發(fā)現(xiàn)這兩種密碼子都編碼纈氨酸，對(duì)編碼的ISG15蛋白質(zhì)氨基酸序列并無(wú)改變，證明穿梭載體PCDNA3.1（+）-ISG15構(gòu)建成功（圖5）。

圖4 PCDNA3.1（+）-ISG15測(cè)序結(jié)果起始密碼子ATG及終止密碼子TAA用黃色標(biāo)記

圖5 BLAST比較構(gòu)建isg15序列方框處為同義突變

3 討論

ISG15是第一個(gè)被鑒定的類(lèi)泛素蛋白質(zhì)，能夠靶向修飾多種蛋白質(zhì)，參與并調(diào)控多種生理功能。目前研究發(fā)現(xiàn)ISG15在抗病毒、自身免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生等反應(yīng)中都發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是IFN的關(guān)鍵效應(yīng)因子［9］。ISG15在自身免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生中的具體作用機(jī)制尚未明確，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)ISG15在許多腫瘤中高表達(dá)，通過(guò)NF-κB通路或泛素化途徑調(diào)控腫瘤發(fā)生，但仍需要進(jìn)一步深入研究。為進(jìn)一步探索ISG15在腫瘤中的功能，本研究構(gòu)建了人源PCDNA3.1（+）-ISG15穿梭載體，可用于ISG15的功能研究，為進(jìn)一步研究ISG15在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。