許志鵬，葉 偉，光 磊，王 智，丁 見 ， 王 林

(1.皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院2016級(jí)，安徽 蕪湖 241002;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種緩慢進(jìn)行的中樞神經(jīng)退行性疾病，其特征是認(rèn)知能力及行動(dòng)能力的退化越來越嚴(yán)重，逐漸喪失生活能力[1]。通過將STZ注入側(cè)腦室可引發(fā)大鼠皮質(zhì)與海馬的葡萄糖代謝減慢，導(dǎo)致突觸丟失、神經(jīng)元損傷，使Aβ異常增加，形成AD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2]。SIRT1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Sirtuins家族成員之一，它能夠參與抗氧化應(yīng)激、抗感染和抗凋亡等過程，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性病變時(shí)，SIRT1通過上調(diào)表達(dá)量，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。FOXO3a是FOX (forkhead box) 蛋白家族的一個(gè)重要成員，通過磷酸化、泛素化降解、乙酰化或去乙?；癿icroRNA方式在抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、促進(jìn)凋亡及氧化應(yīng)激和延長(zhǎng)壽命中發(fā)揮重要作用[3]。杏仁核 ( amygdale) 是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其具有處理情感反應(yīng)和記憶等功能。在阿爾茨海默癥的疾病治療中，針灸干預(yù)AD的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在減少Aβ沉積、抑制Tau蛋白過度磷酸化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)中樞神經(jīng)傳遞、改善能量代謝、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激以及調(diào)控炎性反應(yīng)等方面[4]。而電針是電刺激結(jié)合針灸，能夠減少腦內(nèi) Aβ1-42的異常沉積、改善AD大鼠的認(rèn)知功能障礙從而達(dá)到治療AD的目的。所以本實(shí)驗(yàn)通過研究電針對(duì)AD大鼠杏仁核SIRT1和FOXO3a表達(dá)的影響，探討電針對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 成年雄性SD健康大鼠36只，體重(200 ± 20)g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可號(hào)SCXK(浙)2014-0001。放在室溫21～25 ℃，相對(duì)濕度60 %～65 %的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，自由采光與飲水。隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和電針組，每組12只(6只用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，6只用于Western Blot實(shí)驗(yàn))。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的操作和處理嚴(yán)格遵守2006年國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素(STZ-S0130)購自Sigma公司；通透液(P0097-100ml)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；SIRT1(bs-2257R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；FOXO3a(bs-1548R)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔IgG-免疫組化試劑盒(SABC濃縮型)(SA2002 1/4KIT)購自博士德生物工程有限公司；Nissl staining溶液購自北京索萊寶科技有限公司；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購自德國(guó)Leica公司，華佗牌電子針療儀購自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，BX51顯微鏡和Express C圖像分析系統(tǒng)購自日本的OLYMPUS，還有低溫超速離心機(jī)、制冰機(jī)、電熱恒溫箱、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、高壓蒸汽滅菌箱等。

1.3模型制備 動(dòng)物術(shù)前采用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉劑量為300 mg/kg。待麻醉藥起效后，將大鼠固定在立體定位儀上(耳桿不要插入過深)；固定后，在頭部進(jìn)行備皮和消毒，沿矢狀線做一切口(約1.5 cm)。參考《大鼠腦立體定向圖譜》，在各組大鼠中線旁1.4 mm，前囟后0.8～0.9 mm處鉆孔，深度3.6 mm，用微量進(jìn)樣器注射10 %鏈脲佐菌素(人工腦脊液為溶媒)約3 μL/100 g進(jìn)入每側(cè)側(cè)腦室，第3 d重復(fù)注射此劑量。對(duì)照組注射等量人工腦脊液代替10 % STZ。每次注入5 min，留針3 min。使用無菌骨蠟封閉鉆孔，縫合消毒。術(shù)后肌注青霉素,連用3 d。

1.4治療方法 對(duì)照組和模型組不給予任何治療手段。對(duì)電針組大鼠用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，麻醉成功后將大鼠側(cè)臥位放置，對(duì)“大椎”穴和“足三里”穴，用頻率2 HZ、強(qiáng)度3 V、波寬1 ms的連續(xù)波連續(xù)電針治療4周，1次/d，30 min/次。

1.5水迷宮檢測(cè) 定位航行時(shí)間：歷時(shí)5天，將平臺(tái)放在第4象限，離水面約1～2 cm，平臺(tái)距離池壁約30 cm，第1天將每組大鼠引至平臺(tái)適應(yīng)10 s，以第2象限為入水點(diǎn)，在水池中自由游泳120 s。之后的第2 d至第5 d將各組大鼠分別從4個(gè)象限的相同投放點(diǎn)面壁放入水中，用錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(在平臺(tái)滯留時(shí)間超過5s定為找到平臺(tái))，即逃避潛伏期。以120 s為限，若未找到，則將大鼠引至平臺(tái)學(xué)習(xí)10～15 s，將其擦干，放回籠中，記錄該鼠的逃避潛伏期為120 s。每天訓(xùn)練4次，4次訓(xùn)練的逃避潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第6 d將平臺(tái)撤去，將大鼠按照相同方法從4個(gè)象限放入水中，記錄大鼠120 s內(nèi)在平臺(tái)象限的滯留時(shí)間和穿越原平臺(tái)的次數(shù)。

1.6標(biāo)本取材 治療結(jié)束后，各組大鼠采用30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，暴露心臟，用4 ℃ 4 %多聚甲醛磷酸緩沖液經(jīng)左心室升主動(dòng)脈灌注固定后，根據(jù)George Paxinos的《大鼠腦定位立體圖譜》取出腦組織，放入4 %多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。

1.7免疫組化檢測(cè) 取各組大鼠腦組織石蠟切塊進(jìn)行切片，片厚5 μm。按免疫組化試劑盒說明書依次各步驟，封片，鏡下觀察。結(jié)合顯微鏡、大鼠腦立體定位圖譜、圖像分析系統(tǒng)對(duì)杏仁核部的SIRT1和FOXO3a的免疫陽性細(xì)胞進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)和測(cè)灰度值，并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量和平均灰度值。

1.8Western blot實(shí)驗(yàn) 制膠(10 %分離膠，5 %濃縮膠)，加樣(每一組的樣本連續(xù)加三次)，電泳，轉(zhuǎn)膜(電泳和轉(zhuǎn)膜采用冰水浴)；封閉：5 %脫脂牛奶，放在搖床上，室溫下2 h。TBST洗10 min，洗3次；放在一抗(用一抗稀釋液稀釋一抗，SIRT1稀釋比例1∶1 000，F(xiàn)OXO3a稀釋比例1∶1 000)中孵育，4 ℃過夜(>12h)；TBST洗10 min，洗3次；放在二抗(用5%脫脂牛奶稀釋二抗，稀釋比例1∶5 000)中，室溫下放在搖床上2 h；TBST洗10 min，洗3次；曝光。測(cè)定各組大鼠杏仁核中β-actin、SIRT1和FOXO3a蛋白的光密度值，得到其相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力的比較 模型組大鼠4d平均逃避潛伏期高于對(duì)照組(P<0.05)；平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比低于對(duì)照組(P<0.05)；電針組大鼠的4d平均逃避潛伏期低于模型組(P<0.05)，平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比高于模型組(P<0.05)。見圖1。

2.2各組杏仁核中SIRT1和FOXO3a表達(dá)的比較 在光學(xué)顯微鏡下可見切片上大鼠杏仁核有胞膜和胞漿呈棕黃色的SIRT1陽性神經(jīng)元和FOXO3a陽性神經(jīng)元。模型組SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量相比對(duì)照組顯著減少(P<0.05)，而染色明顯變淺，平均灰度值顯著增加(P<0.05)；電針組的SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量相比模型組顯著增加(P<0.05)，染色明顯加深，平均灰度值顯著降低(P<0.05)。模型組FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量相比對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而染色明顯加深，平均灰度值顯著降低(P<0.05)；電針組的FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量相比于模型組顯著減少(P<0.05)，而染色明顯變淺，平均灰度值顯著增加(P<0.05)。見圖2。

2.3各組杏仁核中SIRT1和FOXO3a蛋白行對(duì)表達(dá)量的比較 模型組中的SIRT1蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，電針組中SIRT1蛋白的表達(dá)較模型組顯著升高(P<0.05)；模型組中的FOXO3a蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，電針組中的FOXO3a蛋白的表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)。見圖3。

3 討論

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease，AD)俗稱老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行疾病，會(huì)導(dǎo)致人的認(rèn)知記憶功能障礙。其主要病變?yōu)椋篈β異常聚集和老年斑的沉積形成；杏仁核、海馬、顳葉等部位神經(jīng)元丟失；神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)和顆粒空泡變性(granulovacuolar degeneration，GD)等。Horínek等研究發(fā)現(xiàn)在AD早期，杏仁核與海馬有著同樣的診斷價(jià)值，并且都在短期記憶過程中發(fā)揮重要作用；當(dāng)AD出現(xiàn)輕微的精神癥狀時(shí)，杏仁核普遍發(fā)生了早期的損害。Hampel等研究表明杏仁核不僅是AD腦內(nèi)重要的病變部位之一，而且其Aβ異常沉積發(fā)生的時(shí)間可能比海馬、皮質(zhì)等區(qū)域更早。所以我們選用杏仁核區(qū)域作為本實(shí)驗(yàn)的研究部位。Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)到各組AD大鼠的平均逃避潛伏期明顯高于對(duì)照組，各組AD大鼠的平臺(tái)象限滯留時(shí)間百分比明顯低于對(duì)照組。據(jù)此推斷實(shí)驗(yàn)造模成功，可用于接下來的治療研究。

阿爾茨海默癥的病因、發(fā)病機(jī)理至今不明，其病因假說中包括基因?qū)W說，堿能學(xué)說，鈣代謝紊亂學(xué)說，鋁中毒學(xué)說，自由基損傷學(xué)說等。AD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，其中涉及的因素包括攜帶易感基因、淀粉樣蛋白在腦內(nèi)的沉積、炎癥和氧化應(yīng)激、突觸受損等[5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1，SIRT1)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Sirtuins家族成員之一。最新研究顯示，上調(diào)SIRT1表達(dá)水平及活性可起到一定的神經(jīng)保護(hù)作用，對(duì)AD有著重要的影響[6]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a是Forkhead家族的一個(gè)重要成員，參與細(xì)胞的凋亡及抗氧化應(yīng)激，并具有延長(zhǎng)壽命的作用[3]。SIRT1-FoxO3a通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用已被證實(shí)，SIRT1通過去乙酰化降解FOXO3a，降低FOXO3a蛋白水平，抑制FOXO3a誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)能力，發(fā)揮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化的結(jié)果顯示，模型組FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量相比對(duì)照組顯著增加(P<0.05)，而染色明顯加深，平均灰度值顯著降低(P<0.05)；模型組SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量相比對(duì)照組顯著減少(P<0.05)，而染色明顯變淺，平均灰度值顯著增加(P<0.05)。Western Blot的結(jié)果顯示，模型組中的FOXO3a蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，模型組中的SIRT1蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。FOXO3a與SIRT1在模型組和對(duì)照組中的表達(dá)趨勢(shì)相反，這與SIRT1通過去乙?；到釬OXO3a，降低FOXO3a蛋白水平這個(gè)觀點(diǎn)相一致。

電針療法是指毫針刺入腧穴得氣后，在針具上通以接近人體生物電的微量脈沖電流，利用針和電的兩種刺激，激發(fā)并調(diào)整經(jīng)絡(luò)之氣以防治疾病的一種方法。大椎穴是督脈經(jīng)的主要穴位，督脈入絡(luò)于腦，具有“通督調(diào)神，健腦益髓”的作用[8]。通過電針刺激“足三里”穴可能通過下調(diào)AD小鼠大腦皮層APP及Aβ蛋白的表達(dá)水平，從而抑制老年斑的形成，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，延緩AD進(jìn)程。電針治療緩解AD癥狀的途徑之一是干預(yù)Aβ的生成途徑，即調(diào)控β分泌酶的表達(dá)，抑制淀粉樣前體蛋白APP的異常水解[9]。研究表明電針可通過上調(diào)AD大鼠額葉皮質(zhì)SIRT1的表達(dá)，增強(qiáng)腦組織抗氧化應(yīng)激能力，從而達(dá)到對(duì)AD大鼠的腦保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)中，免疫組化結(jié)果顯示，電針組的SIRT1陽性神經(jīng)元數(shù)量相比模型組顯著增加(P<0.05)，染色明顯加深，平均灰度值顯著降低(P<0.05)；電針組的FOXO3a陽性神經(jīng)元數(shù)量相比于模型組顯著減少(P<0.05)，而染色明顯變淺，平均灰度值顯著增加(P<0.05)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針組中SIRT1蛋白的表達(dá)較模型組顯著升高(P<0.05)，電針組中的FOXO3a蛋白的表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05)。這些結(jié)果反映出電針可以增加大鼠大腦中SIRT1的表達(dá)水平，降低了大鼠大腦中FOXO3a的表達(dá)水平，提示電針可能通過增強(qiáng)腦組織的抗氧化應(yīng)激能力，促進(jìn)神經(jīng)纖維的良性再生，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的損傷修復(fù)作用。可以看出電針通過上調(diào)SIRT1，下調(diào)FOXO3a，對(duì)AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶有著改善作用，但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。