王 蓉

（湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院圖書館，湖南 衡陽 421005）

類胡蘿卜素是最大的一類天然有機(jī)色素，在一些微生物和植物中均有發(fā)現(xiàn)[1]。SUTTER 與WHITAKER[2]將類胡蘿卜素進(jìn)行分類，劃分為碳水化合物類胡蘿卜素和氧化的葉黃素兩組，代表物分別為β-胡蘿卜素和蝦青素。能合成類胡蘿卜素的微生物有藻類、霉菌、酵母、細(xì)菌[3]。對比來說，酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素更具優(yōu)勢，原因是酵母為單細(xì)胞生物，且生長周期短[4]。紅酵母發(fā)酵存在較多影響因素，其中比較重要的是周圍環(huán)境與發(fā)酵參數(shù)，尤其是培養(yǎng)基條件[5]。

本文采用從蘋果皮上分離得到的菌株黏性紅酵母WP3[6]進(jìn)行類胡蘿卜素發(fā)酵。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別是碳源、氮源、接種量和初始pH 值4 個(gè)因素。接著對單因素試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，得出其中的顯著性因素。而后采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化類胡蘿卜素生產(chǎn)，得到最佳參數(shù)。以最佳參數(shù)發(fā)酵，將得到的實(shí)際類胡蘿卜素產(chǎn)量與預(yù)測值進(jìn)行比較，以期用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 黏性紅酵母產(chǎn)培養(yǎng)基條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)菌株：Rhodotorula mucilaginosaWP3[6]，使用試劑為國產(chǎn)分析純，參見文獻(xiàn)[7]。

1.2 儀器與設(shè)備

使用儀器參見文獻(xiàn)[8]。

1.3 試驗(yàn)培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，補(bǔ)水至1 000 mL，自然pH 值。

MS3 培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母粉1.5 g，NH4NO35 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，補(bǔ)充自來水至1 000 mL（添加微量元素）[9]。

MS3-A 培養(yǎng)基：酵母粉1.5 g，KH2PO41 g，NH4NO35 g， MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，補(bǔ)充自來水至1 000 mL（添加微量元素）。

MS3-1 培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，酵母粉1.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，補(bǔ)充自來水至1 000 mL（添加微量元素）。

MS3-2 培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，KH2PO41 g，NH4NO35 g，NaCl 0.4 g， MgSO4·7H2O 0.4 g，補(bǔ)充自來水至1 000 mL（添加微量元素）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 保藏菌種

配制斜面培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基加熱融化，分裝到試管，然后將分裝的試管放入滅菌鍋滅菌，趁熱擺出斜面。用接種環(huán)將菌株WP3 在斜面劃“Z”字形，將劃好的試管放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，之后放入4 ℃冰箱保藏，一個(gè)月轉(zhuǎn)接一次進(jìn)行活化[10]。

1.4.2 培養(yǎng)種子

用接種環(huán)挑一環(huán)活化的菌株WP3 接種于裝有50 m LMS3 培養(yǎng)基的150 mL 錐形瓶中，在30 ℃，150 r/min[11]的搖床中培養(yǎng)3 d。取5 mL 培養(yǎng)液放入裝有50 mL MS3 培養(yǎng)基的容量為150 mL 的錐形瓶中，在30 ℃，150 r/min 的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)液離心，取細(xì)胞沉淀加無菌水，混勻后計(jì)數(shù)，使接種量一致達(dá)到107個(gè)/mL[12]。

1.4.3 搖床發(fā)酵

無菌吸取一定量的種子液放入裝有300 mL 培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶中，使接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d[4]，一次做3 組平行試驗(yàn)[13]。

1.4.4 測定生物量

將發(fā)酵液搖勻，取一定量該液體離心去上清，加等體積水重懸，應(yīng)用紫外可見分光光度計(jì)測其在600 nm 處的吸光度值[14]。

1.4.5 提取類胡蘿卜素

提取方法參見文獻(xiàn)[8]。

1.4.6 測定類胡蘿卜素含量

用紫外可見分光光度計(jì)測定發(fā)酵液在最大吸收波長450 nm 處的吸光度值，類胡蘿卜素含量的計(jì)算公式[14]為

式中：A為測定液在450 nm 處的吸光度值；V為測定液體積為消光系數(shù)，指450 nm 的光線透過裝有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)徑為10 mm 的比色杯時(shí)的吸光度值；P為用來提取類胡蘿卜素的發(fā)酵液體積，L。

1.4.7 單因素試驗(yàn)

1.4.7.1 培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)

1.4.7.1.1 最佳碳源的確定

往MS3-A 培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量濃度為30 g/L的不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、甘油），自然pH 值，裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，使接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，以研究最適碳源。

以MS3-A 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各加入果糖，使其質(zhì)量濃度分別為10 g/L，20 g/L，30 g/L，40 g/L，50 g/L，維持自然pH，裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，以研究最佳碳源質(zhì)量濃度。

1.4.7.1.2 最佳氮源的研究

1） 無機(jī)氮源。往MS3-1 培養(yǎng)基里各加入不同氮源（KNO312.63 g，NH4Cl 6.69 g，NH4NO35 g），使含氮量達(dá)到1.75 g/L，裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，以研究最佳無機(jī)氮源。

在MS3-1 培養(yǎng)基里加入不同質(zhì)量濃度的NH4Cl（1.15 g/L，2.29 g/L，3.44 g/L，4.59 g/L，5.73 g/L，6.88 g/L），裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，以研究最佳無機(jī)氮源濃度。

2） 有機(jī)氮源。往MS3-2 培養(yǎng)基里各加入質(zhì)量濃度為10 g/L 的有機(jī)氮源（尿素、酵母粉、蛋白胨），裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量測定，以研究最適有機(jī)氮源。

以MS3-2 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各加入酵母粉，使質(zhì)量濃度分別為3 g/L，5 g/L，10 g/L，15g/L，裝液量為300 mL/500 mL。將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。結(jié)束培養(yǎng)后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，以研究最佳有機(jī)氮源濃度。

1.4.7.2 搖床發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

1） 接種量。配制MS3 培養(yǎng)基，裝液量均為300 mL/500 mL，使接種量變化，各達(dá)105個(gè)/mL、105.5個(gè)/mL、106個(gè)/mL、106.5個(gè)/mL、107個(gè)/mL，置30 ℃，150 r/min 的條件下發(fā)酵7 d。終止發(fā)酵后，進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，求得最適接種量。

2） 初始pH 值。配制MS3 培養(yǎng)基，裝液量為均300 mL/500 mL，使初始pH 值不同，分別為4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，將菌株WP3 接種至培養(yǎng)基中，接種量為107個(gè)/mL。在30 ℃，150 r/min 的搖床中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，測量類胡蘿卜素含量和生物量，得出最佳初始pH 值。

1.4.8 單因素試驗(yàn)的方差分析

綜合試驗(yàn)對類胡蘿卜素含量的影響，對單因素試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，根據(jù)P值選出顯著的影響因子（P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異高度顯著，P＜0.001 為差異極顯著）[15]。

1.4.9 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，得出對類胡蘿卜素含量影響的顯著因子，選擇Design Expert 8.0 軟件[16]，將響應(yīng)值設(shè)為類胡蘿卜素含量，進(jìn)一步優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝參數(shù)，用該參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 黏性紅酵母產(chǎn)培養(yǎng)基條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分的單因素試驗(yàn)

2.1.1 最佳碳源的確定

培養(yǎng)結(jié)束后，測量類胡蘿卜素含量和生物量，結(jié)果見文獻(xiàn)[8]。通過分析得出果糖為最佳碳源，最佳果糖質(zhì)量濃度為40 g/L。

2.1.2 最佳氮源的研究

1） 無機(jī)氮源。培養(yǎng)結(jié)束后，測量類胡蘿卜素含量和生物量，結(jié)果見文獻(xiàn)[7]。通過分析得出最佳氮源為氯化銨，最佳氯化銨氮質(zhì)量濃度為0.9 g/L，即氯化銨質(zhì)量濃度為3.44 g/L。

2） 有機(jī)氮源。培養(yǎng)結(jié)束后測量類胡蘿卜素含量和生物量，見圖1 和圖2（均顯示均值標(biāo)準(zhǔn)差）。

圖1 幾種有機(jī)氮源對Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和類胡蘿卜素合成的影響

圖2 不同濃度酵母粉對Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和類胡蘿卜素合成的影響

由圖1 可見添加尿素時(shí)生物量最小，細(xì)胞生長不好，而添加酵母粉時(shí)生物量最大，菌株長勢較好，表明加入尿素不適于紅酵母生長；而加入酵母粉時(shí)，測得最大類胡蘿卜素含量，加入蛋白胨時(shí)，得到最小類胡蘿卜素含量，表明添加蛋白胨對合成類胡蘿卜素不利，綜合可見酵母粉是最佳有機(jī)氮源。FERRAO 等[17]研究禾本紅酵母RC04 在β-胡蘿卜素合成和細(xì)胞生長時(shí)不同碳源的影響，得出有機(jī)氮源中最利于細(xì)胞生長和β-類胡蘿卜素合成的有機(jī)氮源也是酵母粉。

由圖2 可見酵母粉濃度越大，菌株生物量也越大，表明稍高濃度酵母粉促進(jìn)菌株生長。添加質(zhì)量濃度為15 g/L 酵母粉，得到最低類胡蘿卜素含量，表明類胡蘿卜素的次級代謝合成同菌株生長不是正比關(guān)系。添加質(zhì)量濃度為10 g/L 酵母粉，得到類胡蘿卜素含量最大，細(xì)胞長勢也較好，說明酵母粉最佳質(zhì)量濃度為10 g/L。翟紅梅[18]用紅酵母進(jìn)行5 L罐發(fā)酵，結(jié)果顯示質(zhì)量濃度為20 g/L 是酵母粉最適宜質(zhì)量濃度，此試驗(yàn)與本研究有出入，大致緣由是菌株差異。

2.2 搖床發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

1） 接種量。結(jié)束培養(yǎng)后進(jìn)行生物量與類胡蘿卜素含量的測定，見圖3（顯示均值標(biāo)準(zhǔn)差）。

圖3 接種量對Rhodotorula mucilaginosa WP3生物量和類胡蘿卜素合成的影響

由圖3 可見，當(dāng)接種量達(dá)到3.16×105個(gè)/mL（即105.5個(gè)/mL） 時(shí)，得到最小生物量；而當(dāng)接種量達(dá)到1×106個(gè)/mL 時(shí)，得到最大生物量，表明菌株生長的最佳接種量是1×106個(gè)/mL。但接種量達(dá)到1×106個(gè)/mL 時(shí)，所得類胡蘿卜素含量卻最??；接種1×105個(gè)/mL 時(shí)，得到最大類胡蘿卜素含量，這表明類胡蘿卜素合成同菌株生長不是正比關(guān)系，1×105個(gè)/mL 是最適宜接種量。Govindaswamy Vijayalakshmi 等[19]優(yōu)化紅酵母類胡蘿卜素合成，接種量表達(dá)形式不同，為6.0 mL/100 mL。

2） 初始pH 值。培養(yǎng)結(jié)束后，測量類胡蘿卜素含量和生物量，結(jié)果見文獻(xiàn)[8]。分析該圖得出最適初始pH 值為7.5。

2.3 單因素試驗(yàn)的方差分析

方差分析單因素試驗(yàn)，研究其對類胡蘿卜素含量的影響。從第84 頁表1 可見，果糖濃度與初始pH 值對類胡蘿卜素含量影響極顯著，酵母粉質(zhì)量濃度對類胡蘿卜素含量影響高度顯著，而接種量和NH4Cl 質(zhì)量濃度影響類胡蘿卜素含量不顯著。根據(jù)單因素試驗(yàn)對類胡蘿卜素含量的影響，選出3 個(gè)影響因子：初始pH 值、果糖質(zhì)量濃度、酵母粉質(zhì)量濃度，并將響應(yīng)值設(shè)為類胡蘿卜素含量，進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化。

表1 單因素試驗(yàn)對類胡蘿卜素含量的方差分析表

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

1） 優(yōu)化方案。研究紅酵母菌株類胡蘿卜素合成，單因素試驗(yàn)后用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，軟件應(yīng)用Design Expert 8.0，選擇Box-Behnken 設(shè)計(jì)，確定3 個(gè)考察因子：初始pH 值A(chǔ)、果糖質(zhì)量濃度B、酵母粉質(zhì)量濃度C，將響應(yīng)值設(shè)為類胡蘿卜素質(zhì)量濃度Y，三水平三因子優(yōu)化發(fā)酵，方案設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表2 和表3。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)菌株發(fā)酵，得到的類胡蘿卜素含量比單因素試驗(yàn)高43.96%。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子與水平取值

采用響應(yīng)面法回歸分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)（見表3），綜合可得以類胡蘿卜素含量為響應(yīng)值的三因子（初始pH 值A(chǔ)、果糖質(zhì)量濃度B、酵母粉質(zhì)量濃度C） 的三元二次回歸方程為

對此方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)與方差分析，結(jié)果見表4。從表4 可見，回歸模型P值＜0.000 1，表明得到的模型差異極顯著，模型的失擬項(xiàng)P值為0.144 7＞0.05，表明失擬項(xiàng)差異不顯著，此方程模型與發(fā)酵情形很好擬合，因而發(fā)酵可用模型代替進(jìn)行結(jié)果分析。該模型的（決定系數(shù)）為0.999 2，表明99.92%類胡蘿卜素含量的變化能用此模型解釋，實(shí)際發(fā)酵中用此模型僅存在0.08%的變異不能說明。所以研究所得模型能可靠地應(yīng)用于試驗(yàn)菌株的發(fā)酵，能夠預(yù)測試驗(yàn)得到的類胡蘿卜含量，清楚其變化。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值

表4 回歸模型方差分析

2） 最佳發(fā)酵參數(shù)的預(yù)測及驗(yàn)證。綜合處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測，得到發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)：酵母粉質(zhì)量濃度為7.13 g/L，果糖質(zhì)量濃度為41.70 g/L，初始pH 值為7.61。將最優(yōu)參數(shù)代入方程得到類胡蘿卜素質(zhì)量濃度預(yù)測值為678.967 μg/L。采用最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，得類胡蘿卜素含量試驗(yàn)值為678.048 μg/L，預(yù)測值和試驗(yàn)值接近，表明選擇響應(yīng)面方案所得模型與參數(shù)可信度高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)先開展單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)菌株類胡蘿卜素合成工藝，建立了顯著影響因子對類胡蘿卜素含量的三元二次回歸方程模型，通過驗(yàn)證，該回歸模型可信度高，能用來預(yù)測類胡蘿卜素含量。綜合單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出試驗(yàn)菌株最佳發(fā)酵參數(shù)是果糖質(zhì)量濃度為41.70 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為7.13 g/L，初始pH 值為7.61。以最佳參數(shù)預(yù)測與驗(yàn)證，類胡蘿卜素質(zhì)量濃度實(shí)際值為678.048 μg/L，預(yù)測值為678.967 μg/L，實(shí)際值與預(yù)測值很接近。