孟凡強， 劉 燕， 吳勇杰， 陶 可， 孫 康

(上海交通大學 材料科學與工程學院 金屬基復合材料國家重點實驗室， 上海 200240)

作為一種具有高分辨率、高靈敏度、無組織損傷且能深層穿透的診斷方法，磁共振成像(magnetic relaxation imaging，MRI)被廣泛地應用于醫(yī)學研究領域[1-3]。1973年Lauterbur[4]首次提出將氫原子用于磁共振成像，其原理是施加脈沖磁場擾亂已經(jīng)在磁場中達到平衡的氫原子，利用撤銷脈沖磁場后氫原子恢復到基態(tài)的差異產(chǎn)生影像信號。目前臨床及醫(yī)學研究中使用的核磁共振造影方法主要是1H MRI。1H MRI利用組織中氫原子的不同弛豫特性來提供具有空間分辨率和軟組織對比度的生理學和解剖學信息[5-9]，同時引入的對比劑(contrast agent，CA)能夠局部改變氫質(zhì)子的弛豫使影像信號增強，從而進一步提高1H MRI的分辨率[1]。但由于生物體內(nèi)的含水量高(>60%)，組織內(nèi)部及不同組織間的磁共振影像信號容易相互干擾，引起高的背景噪聲，降低影像的分辨率。此外，近年來1H MRI對比劑的安全性問題也引起廣泛的關注。研究發(fā)現(xiàn)1H MRI對比劑會在體內(nèi)殘余并積累，尤其是反復使用對比劑后，MRI或其他影像方法可以直接檢測到對比劑在人體部位如大腦的齒狀核和蒼白球部位[10]的殘余。內(nèi)源性1H MRI背景噪聲和對比劑的安全性問題促進了非氫核核磁影像技術的發(fā)展，其中19F MRI因其特點引起廣泛關注。

19F具有和1H相似的核磁共振譜線(nuclear magnetic relaxation, NMR)[11]；19F自旋比為1/2；磁旋比與1H接近(19F: 40.08 MHz/T, 1H: 42.58 MHz/T)；敏感度是1H的83%; 化學位移分布在較寬范圍(> 350 ppm)[11]；另外，19F在人體內(nèi)的含量很少，而且主要被固定在固相的骨骼和牙齒中，使得其橫向弛豫時間(或自旋-自旋弛豫時間，T2)非常短，信號遠低于MRI儀器檢測極限[12]。所以，內(nèi)源的19F不會在成像過程中產(chǎn)生背景信號，使得19F MRI造影劑呈現(xiàn)“熱點”性質(zhì)(在磁共振影像中只有造影劑顯影而呈現(xiàn)出一種亮點狀態(tài))[13]。

目前，19F磁共振造影技術已經(jīng)被應用于各個研究領域，其中廣泛使用的19F MRI造影劑主要是全氟化碳類(perfluorocarbons，PFCs)有機物，這類有機造影劑能夠通過19F原子取代或支鏈化獲得更高的19F原子載量和更合適的弛豫時間。近年來也有研究提出無機氟化物納米粒子可以用作19F MRI造影劑[14]。本文主要介紹19F MRI造影劑的特點、研究進展和應用前景。

1 19F MRI造影劑研究進展

1.1 19F磁共振成像性能

19F MRI的成像機理和1H MRI相似，同樣利用撤銷脈沖磁場后原子恢復到基態(tài)過程中磁場的變化產(chǎn)生影像信號。在自旋回波序列中，19F MRI影像強度的公式見式(1)[15]。

(1)

其中，I是影像強度，N(F)是核磁成像儀器成像單元體素中含有氟原子的濃度，TR和TE是脈沖序列重復時間和回波時間，T1是自旋-晶格弛豫時間，T2是自旋-自旋弛豫時間。

為了提高MRI成像性能，19F MRI造影劑應該具有以下幾個特點[8]：

(1) 高19F含量。

(2) 短T1和長T2。短的T1時間有助于19F MRI在單位時間內(nèi)進行更多次的信號采集而增強信噪比；同時延長T2時間意味著減小偶極-偶極之間的相互作用，可以保證采集信號的強度[15,16]。

(3) 簡單的19F NMR譜線、盡可能尖銳的單峰。單個19F NMR譜線峰可以避免出現(xiàn)化學位移偽影[17]，同時NMR譜峰越尖銳，意味著T2時間可能越長[18]。

(4) 高生物相容性和穩(wěn)定性。

(5) 盡可能簡單的合成方法。

1.2 有機19F MRI造影劑

有機19F磁共振造影劑主要是全氟化碳類(PFCs)。全氟化碳是一類由19F原子全部或部分取代1H原子的有機物[12]。PFCs作為19F MRI造影劑有諸多優(yōu)點：高的19F載量[12]、穩(wěn)定的生物和化學性質(zhì)[19]、較長的T2，有利于信號的采集和處理[20]。但大多數(shù)有機氟化物憎水，并且生物體內(nèi)缺乏其降解相關的酶和通路，所以有機氟化物會在體內(nèi)大量聚集[21]。目前使用最多的PFCs造影劑有三種：全氟辛基溴(perfluorooctyl bromide, PFOB)、全氟十五冠醚(perfluoro[15]-crown-[5]ether, PCE)和線性全氟聚醚(perfluoropolyethers, PEPEs)[21]。其中，PFOB和PCE分子量比較小。因其憎水特性，在應用PFCs造影劑時需要使用表面活性劑和先進的分散設備[22,23]將其分散在水系溶液中形成穩(wěn)定的乳液(圖1)[24]。

圖1 乳液中全氟化碳納米液滴的結構示意圖單層表面活性劑將液態(tài)的全氟化碳包裹在納米液滴核心中，常見的核心是PFOB、PCE等。核心中也可以包含其他造影劑或順磁性化合物等。特異性的配體可以是抗體、酶等，用于體內(nèi)成像時的特異性結合或體內(nèi)特異性的檢測。載體可以用來承載藥物或其他功能性基團[24]

1.2.1小分子全氟化碳(PFOB，PCE)

全氟辛基溴(perfluorooctyl bromide, PFOB, 圖2a)是含有8個碳原子、氫原子全部被氟原子取代的直鏈烷基溴化物。最早由Ratner等[25]提出將PFOB用于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的19F MRI。利用PFOB造影時，往往需要加入表面活性劑使其形成穩(wěn)定的乳液。其中，表面活性劑可以與熒光劑、超聲劑等復合實現(xiàn)“多模式”造影[26-29]。另外，PFOB也可以和功能性的高分子，例如聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]結合。PLGA包裹的PFCs具有更好的尺寸穩(wěn)定性，并且能夠提供更加穩(wěn)定的表面便于與抗體結合[30]。在Pisani等[28]的研究中，PLGA包裹液態(tài)的PFOB可以制備出粒徑不同、包裹厚度和半徑比變化的微球(圖2b)，并實現(xiàn)體外超聲(圖2c)和19F MRI(圖2d)雙模態(tài)顯影。近年來有研究人員提出用微囊化技術[31,32]將干細胞與全氟化碳結合，然后將被標記的細胞注入動物體內(nèi)，利用氟化物的“熱點”效應[33]研究細胞的移植率、分布、存活率等問題[34-36]。在最近Fu等[37]的研究中，研究人員通過微囊化技術將干細胞、PFOB以及海藻酸鹽等相結合，用于解決干細胞移植率低等問題并追蹤植入的細胞及其分布。其中PFOB標記的間充質(zhì)干細胞19F載量提高了近10倍[35,36]，并且即使在缺血性組織中也能夠保持細胞活性；同時與未被PFOB標記的間充質(zhì)干細胞相比，具有更高的體內(nèi)活性。但由于PFOB化學結構中所有的19F原子處于非對稱結構，在19F NMR上表現(xiàn)為多個磁共振譜線峰，而多個譜線峰在MRI圖像編碼和重構時容易相互干擾而增加化學位移偽影出現(xiàn)的可能[17]，故其應用受到了一定的限制。

圖2 a. PFOB結構示意圖； b. PFOB微囊TEM照片； c. PFOB微囊注入小鼠體內(nèi)后肝部超聲影像； d. 粒徑150 nm，濃度50 mg/mL的PFOB微囊水溶液19F MRI圖像(左上角插入的是純PFOB 19F MRI)，標尺是1 cm[28]

相對于PFOB，環(huán)狀全氟化碳類化合物具有更好的氟原子等價性、更為單一的核磁譜線，也被廣泛應用于磁共振造影劑。其中，最常用的是全氟十五冠醚(perfluoro[15]-crown-[5]ether, PCE)，見圖3a[21]。PCE中20個氟原子處于化學結構對稱的位置，使得PCE核磁共振譜線只有一個峰，極大程度地減小了化學位移偽影出現(xiàn)的可能，并提高了19F MRI靈敏度[8]，因此被用于體內(nèi)外的細胞示蹤等研究。N?th等[38]用19F MRI技術觀察了PCE標記的巨噬細胞在過敏性腦脊髓炎侵襲等階段中的表現(xiàn)。Kaneda等[24]分別用PFOB和PCE標記細胞以實現(xiàn)同時對不同細胞的體內(nèi)示蹤，這也是首次利用不同的氟化物同時標記細胞進行體內(nèi)示蹤的研究，實驗證實了在沒有使用轉染試劑的條件下干細胞對兩種PFCs的乳液具有高的吞噬率并保留了高的細胞活性和體內(nèi)功能性，實現(xiàn)了體內(nèi)細胞的標記示蹤；并通過核磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)進行了細胞量化。在最近的研究中，磁共振造影劑還被賦予“智能化”的功能。Guo等[39]將釓離子[Gd(Ⅲ)]和PCE用磷脂封裝制備成用于檢測磷脂酶活性的智能開關(圖3b和c)。當Gd(Ⅲ)和PCE被封裝在磷脂殼層內(nèi)部時，Gd(Ⅲ)順磁增強效應(順磁性離子因其具有較大的電子磁矩而改變一定距離內(nèi)與之接觸的造影劑弛豫速率的現(xiàn)象)使得PCE磁共振影像信號快速衰減呈現(xiàn)“關”的狀態(tài)；但當磷脂被周圍環(huán)境中的磷脂酶分解后，Gd(Ⅲ)與PCE被釋放出來，它們之間的距離變大，順磁弛豫增強效果減弱，使得PCE重新具有磁共振影像信號呈現(xiàn)“開”的狀態(tài)，由此可檢測磷脂酶的活性(圖3d)。

圖3 a. PCE結構示意圖； b. 智能磷脂酶19F MRI造影劑開關示意圖； c. 磷脂包裹的PCE納米球TEM照片； d. 不同濃度磷脂酶存在下的智能開關19F MRI[39]

除了PFOB 和PCE 以外，其他小分子全氟化碳也可作為磁共振影像造影劑，比如六氟苯(Hexafluo-robenzene)[40,41]、全氟萘烷(Perfluorodecalin)[42,43]和全氟壬烷(Perfluorononane)[44]等。但這些小分子氟化物本身的一些性質(zhì)限制了它們在MRI造影劑中的應用，比如PFOB多個共振峰可能引起化學位移偽影；PCE難以改性修飾，如果采用共價修飾會破壞PCE的對稱性，將產(chǎn)生多個共振峰；由于全氟化碳的疏水特性需使用表面活性劑而使得制備流程十分復雜；造影效果通常受到乳液不穩(wěn)定性，如絮凝、聚結、納米液滴的奧斯特瓦爾德熟化(一種分子擴散現(xiàn)象，較大顆粒吞噬較小顆粒而逐漸生長)等影響[1,22,23,45,46]。

1.2.2高分子和支鏈聚合物(PEPEs)

提高19F MRI靈敏度的方法之一是提高造影劑的氟含量，聚合線性氟化物是實現(xiàn)造影劑氟含量增加的最簡單的選擇。它們可以是單一聚合物或以全氟聚醚為基礎衍生的多分散混合物[8]。高分子聚合物磁共振成像造影劑的代表是線性全氟聚醚(perfluoropolyethers, PFPEs)，見圖4a，其中所有的氫原子都被氟原子取代。這些化合物物理化學性質(zhì)相似，即高度疏水、輕微疏油、高沸點、低表面張力、高分子量(> 1700 Da)、高氟原子密度等[8]。最早，Ahrens等[1]提出用PEPEs標記樹突細胞進行體內(nèi)細胞的示蹤和量化。高分子全氟化碳分子鏈上有更多的結合位點，可以與其他功能性分子相結合用于多模式顯影。Janjic等(圖4b)[26]將PFPEs和熒光染料相結合，合成了高穩(wěn)定、無毒雙模式納米乳劑，在不使用轉染試劑的情況下能夠有效地標記吞噬和非吞噬細胞，其中熒光基團的引入有助于鑒定和識別由于細胞凋亡、分化等原因造成的19F MRI信號損失，進一步提高了細胞體內(nèi)示蹤的準確性。Zhang等[47]以PFPEs為基，通過修飾親水性基團、熒光染料和特異性的肽適體，制備了具有高19F MRI靈敏度的雙模式造影劑(HBPFPE-apt，HBPFPE-non，見圖5c)，用于乳腺癌檢測。研究證實了此種造影劑比以丙烯酸三氟乙酯為基的高分子造影劑具有更好的橫向弛豫時間和磁共振影像靈敏度(圖5d)。同時，特異性肽適體的修飾提高了乳腺癌細胞的靶向率，并縮短了體內(nèi)循環(huán)的半衰期，有利于體內(nèi)快速清除，降低了生物毒性。

圖4 a. PFPEs結構示意圖； b. 從左到右分別是熒光染料和PFPE雙模式造影劑示意圖、熒光標記細胞的共聚焦圖像和體內(nèi)1H/19F MRI[26]； c. HBPFPE-apt結構示意圖； d. HBPFPE-apt和HBPFPE-non的熒光和19F MRI[47]

另外，可以采用超支鏈化方法提高磁共振成像造影劑中氟原子的含量。在Thurecht等[48]的研究中，通過可逆加成斷裂鏈轉移聚合反應引入功能性分子，并在水溶性條件下充分水合丙烯酸酯和極性重復單元，使化合物具有更高的19F含量和分子移動性。反應中單體的隨機支化阻礙了氟化鏈段的聚集，同時摻入高濃度的氟化物單體。高氟原子含量和分子移動性使造影劑在10 min內(nèi)有清晰的體內(nèi)影像，這也是首個將可功能化制備的共聚物用于體內(nèi)19F MRI的例子。另一個典型的超支鏈氟化物造影劑是由Jiang等[49]提出的19FIT(19F imaging tracer，見圖片5a和5b)，它有27個等效的氟原子，在核磁共振譜線上呈現(xiàn)單峰，并且具有短的縱向弛豫時間。超支鏈氟化物含有大量易于修飾的表面官能團，從而可以和功能性分子結合實現(xiàn)雙模式或多模式顯影[20,50-55]。Wang等[56]合成了一系列支鏈氟化物并結合熒光染料分子，實現(xiàn)雙模式體內(nèi)顯影和定量分析。Chen等[2]通過“一步包封”的方法將氟化物連接在Cu1.75S納米粒子上，同時結合了功能性分子和二氧化硅，實現(xiàn)了19F MRI、光熱成像和光動力治療相結合的多模成像和診療一體化設計。另外，也可以通過調(diào)節(jié)弛豫時間提高19F MRI靈敏度。Kislukhin等[18]將順磁性釓離子、鐵離子引入到PFPEs中，提高了縱向弛豫速率進而提高了磁共振成像的靈敏度。此研究表明鐵離子結合的PFPEs納米乳液具有低細胞毒性(<20%)和優(yōu)異的MRI靈敏度；且其縱向弛豫時間可以通過改變鐵離子的化學計量來調(diào)控，優(yōu)化后的造影劑弛豫時間能夠降低一個數(shù)量級，靈敏度可以提高3～5倍。

近年來有研究將醫(yī)用體內(nèi)支架材料進行氟化處理，用于檢測支架在體內(nèi)的存在狀態(tài)。Lammers等[57]首次將熱塑性聚氨酯無定形氟化聚合物(thermoplastic polyurethane, 19F-TPU)用于制備組織工程中的血管移植物(圖5c，5d)，其19F MRI證明了19F-TPU具有作為可成像血管移植物材料和組織工程治療基礎材料的潛能。另外，F(xiàn)u等[58]通過調(diào)節(jié)氟化物鏈段的移動性將造影劑制備成對活性氧敏感的“開關”，用于改善具有高水平活性氧疾病的診斷和治療精確度。在一項相似的研究中，Huang等[59]利用巰基和氟化物的相互作用，使造影劑中的氟化物分子移動性呈現(xiàn)不一樣的狀態(tài)，實現(xiàn)“開關”功能。該納米探針對生物硫醇具有高靈敏度和選擇性，可實現(xiàn)谷胱甘肽的細胞內(nèi)和瘤內(nèi)成像。

圖5 a. 19FIT結構示意圖； b. 小鼠體內(nèi)1H/19F MRI疊加影像[49]； c. 19F-TPU結構示意圖；d. 19F-TPU 體外1H MRI和19F MRI以及1H/19F MRI[57]

1.3 無機氟化物造影劑

自19F MRI技術被提出以來，19F MRI造影劑主要是有機物，無機物造影劑研究處于空白狀態(tài)。原因在于結晶度高的無機化合物中氟原子被規(guī)律地固定在晶格中，使橫向弛豫時間T2很短，傳統(tǒng)的檢測儀器無法檢測到[59,60]。但結合高性能19F MRI造影劑的特點[8]，無機物可控的化學成分、大小、形狀、表面性質(zhì)和物理特性、簡單的結構、高的對稱性[61,62]等特點都有利于高性能19F MRI成像。2018年Ashur等[14]將UTE(ultrashort echo time，超短回波時間，核磁影像技術中一種信號采集方法)技術用于CaF2納米粒子19F MRI，該技術極大縮短了核磁影像儀器信號采集中的回波時間，減少了造影劑T2時間短對信號采集的影響，成功觀察到無機氟化物造影劑在體內(nèi)外的影像。

Ashur等[14]將無機氟化鈣納米粒子用于19F MRI，并通過對比不同晶格結構納米粒子的19F MRI，提出面心立方的晶格結構是無機納米粒子具備19F MRI造影能力的關鍵性因素。另外，研究測得檸檬酸包覆的CaF2納米粒子(CFP)具有較長的縱向弛豫時間(T1=9.74 s)和短的橫向弛豫時間(T2=2.9 ms)。實驗采用較小的翻轉角，并使用UTE技術減小T1較長和T2較短對成像的不利影響，成功獲得了熒光素修飾的CFP在體內(nèi)的19F MRI影像(圖6e)，證明了CFP用于體內(nèi)19F MRI造影劑的潛力。

圖6 a. CF-Cit 透射電鏡照片； b. CF-Cit流體動力學直徑； c. CF-Cit X射線衍射圖譜和以Ca2+為中心的配位示意圖(Ca2+為灰色，F(xiàn)-為紅色)； d. CF-Cit 19F NMR； e. 熒光素修飾CFP小鼠體內(nèi)1H MRI和19F MRI[14]

總之，不同的19F MRI造影劑因具有不同的特點(表1)[8,14,63]而被逐漸應用于解決不同的醫(yī)學研究問題。

表1 19F MRI造影劑對比

2 結論與展望

近年來，研究人員對于19F MRI廣泛關注，發(fā)現(xiàn)了19F MRI在體內(nèi)外非損可視化顯影中的巨大潛力。與傳統(tǒng)的1H MRI相比，無背景噪聲的優(yōu)點使得19F MRI成為生物醫(yī)學領域的研究熱點。19F MRI造影劑可與靶向劑結合，實現(xiàn)體內(nèi)特異性顯影；并可以通過結合1H MRI，精確地顯示其解剖學位置；或通過修飾其他造影劑實現(xiàn)多模式顯影。經(jīng)過多年的研究、開發(fā)和改良，有機氟化物造影劑已經(jīng)被用于解決醫(yī)學研究中體內(nèi)外細胞的顯影、追蹤、量化等關鍵性問題。無機氟化物造影劑的出現(xiàn)進一步挖掘了19F MRI的潛能，拓展了19F MRI造影劑的應用前景。19F MRI也存在一些問題，比如靈敏度仍需進一步提升，因此需要進一步開發(fā)新一代造影劑或優(yōu)化現(xiàn)有造影劑，比如利用超支鏈化反應進一步提高有機氟化物中19F等價性和19F含量以增加影像信噪比；提高有機物中原子的移動性，增加影像信噪比；將順磁離子修飾在無機晶體造影劑表面或內(nèi)部，利用順磁增強弛豫效應縮短自旋-晶格弛豫時間，以增加影像信噪比；或將無機氟化物和功能性分子結合，實現(xiàn)19F MRI造影劑的多功能化以及多模式造影等。可以期待，隨著對19F MRI造影技術和造影劑更加深入的了解，19F MRI將會被應用于更加廣泛的領域。