黎琴文，黃小燕

1三峽大學(xué)人民醫(yī)院·宜昌市第一人民醫(yī)院，湖北宜昌 443000;2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院

周圍神經(jīng)慢性卡壓損傷指周圍神經(jīng)在特定部位受到周圍組織的壓迫，引起周圍神經(jīng)電生理學(xué)改變，從而導(dǎo)致神經(jīng)支配區(qū)疼痛、感覺及運動功能障礙等[1,2]。慢性神經(jīng)卡壓損傷可導(dǎo)致神經(jīng)組織微血管缺血改變，加重神經(jīng)束膜水腫、增厚及局部纖維化，阻礙周圍神經(jīng)對靶器官的營養(yǎng)作用，加劇肢體運動功能的逐步喪失[3]。該病對患者的心理和社會功能影響較大，其發(fā)生往往隱匿且發(fā)展較為緩慢，及早診斷和治療可以避免周圍神經(jīng)損傷帶來的感覺和運動功能障礙的丟失。多年來對于周圍神經(jīng)慢性卡壓損傷的眾多研究主要集中于卡壓神經(jīng)局部組織和支配骨骼肌的病理機制研究，以往研究報道坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷可致卡壓神經(jīng)局部組織和支配骨骼肌形成纖維化[4,5]。2019年3～12月，本研究探討了坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷是否也可導(dǎo)致背根神經(jīng)節(jié)纖維化的病理改變，并進一步探討背根神經(jīng)節(jié)細胞外基質(zhì)過度沉積的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7～8周齡普通級SD雄性大鼠30只(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物倫理委員會審批，倫理批準號2018030E)，體質(zhì)量250～300 g，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供，按照普通級動物標準飼養(yǎng)和管理大鼠(自由進食飲水，每天交替進行12 h光照、12 h黑暗)。

1．2 實驗試劑 蛋白抽提試劑盒(武漢拜意爾生物公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢拜意爾生物公司)，化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)，正常羊血清(博士德公司)，兔抗Collagen Ⅰ、TGF-β1多克隆抗體(SantaCruz公司)，p-ERK、p-JNK、p-p38多克隆抗體(CST公司)。

1．3 方法

1．3.1 大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型構(gòu)建 取30只SD雄性大鼠，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，大鼠右側(cè)大腿背側(cè)皮膚備皮，消毒后沿右側(cè)坐骨神經(jīng)走形方向切開皮膚，充分顯露右側(cè)坐骨神經(jīng),將內(nèi)徑1 mm、長1 cm硅膠管剖開后，套在顯露的右側(cè)坐骨神經(jīng)周圍，8-0縫線縫合硅膠管切開處，將坐骨神經(jīng)放回原處，逐層縫合傷口，設(shè)為卡壓側(cè)。按照同樣方法暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)后放回原處縫合傷口設(shè)為對照側(cè)。

1．3.2 大鼠腓腸肌肌肉萎縮和纖維增生情況觀察 造模3周和8周時，分別取10只SD雄性大鼠，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用頸椎脫白法處死實驗大鼠，分別切取大鼠卡壓側(cè)坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌樣本及對照側(cè)腓腸肌樣本。腓腸肌經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，取腓腸肌肌腹中段處，橫切3～4 μm厚的連續(xù)薄片。石蠟切片脫蠟至水，鐵蘇木素染色，酸性乙醇分化，氨水返藍，麗春紅品紅染色，乙酸溶液洗，磷鉬酸分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。Masson三色染色后膠原纖維、黏液、軟骨呈藍色；肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色；細胞核呈藍黑色。用ImageJ圖像分析軟件分別測量并計算腓腸肌橫截面積(CSA)和膠原容積分數(shù)(CVF)，CSA和CVF分別用于反映大鼠坐骨神經(jīng)卡壓損傷后腓腸肌發(fā)生肌肉萎縮和纖維增生情況。

1．3.3 大鼠背根神經(jīng)節(jié)Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白檢測 ①造模3周時，取10只SD雄性大鼠，經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，用頸椎脫白法處死實驗大鼠。打開大鼠胸腔，暴露心臟，從左心室進針，剪開右心耳，同時向左心室內(nèi)快速注入37 ℃生理鹽水150 mL直至右心耳流出清亮液體，換4%多聚甲醛500 mL先快后慢注入左心室內(nèi)，直到大鼠肺、肝變白變硬。大鼠背側(cè)皮膚備皮，消毒后切開大鼠背側(cè)皮膚，充分暴露脊柱，咬除脊柱棘突、橫突等，打開髓腔暴露椎管內(nèi)脊髓，牽出脊髓，用顯微鑷分別將雙側(cè)L4～6背根神經(jīng)節(jié)從椎間孔中牽出，見梭形膨大的背根神經(jīng)節(jié)，沿膨大邊緣截取背根神經(jīng)節(jié)。②將上述背根神經(jīng)節(jié)剪成細小碎片，按每20 mg加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液勻漿直至完全裂解，提取背根神經(jīng)節(jié)組織總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度后，將30 μg蛋白加樣在含0.1% SDS的12%聚丙烯酰胺凝膠上，電泳2.5 h后分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜在5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后加入抗體[內(nèi)參GAPDH(1∶10 000)、Collagen Ⅰ(1∶5 000)、TGF-β1(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、p-JNK(1∶1 000)、p-p38(1∶1 000)]4 ℃搖床孵育過夜，抗目的蛋白抗體檢測。洗膜后用過氧化物酶綴合的二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，加入ECL顯色液，最后放入X線片夾中曝光、顯影、定影，將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析，將目標帶/內(nèi)參灰度比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2．1 大鼠卡壓側(cè)、對照側(cè)腓腸肌CSA、CVF水平比較 造模3周時，卡壓側(cè)未見腓腸肌萎縮，但8周時可見腓腸肌萎縮?？▔簜?cè)、對照側(cè)造模3周后腓腸肌CSA分別為(1 225 288±43 570)、(1 248 091±50 846)μm2，造模8周后分別為(797 525±25 846)、(1 239 353±50 846)μm2，兩側(cè)造模8周時相比P<0.05。造模3、8周時，卡壓側(cè)均可觀察到腓腸肌膠原纖維增生?？▔簜?cè)、對照側(cè)造模3周后腓腸肌CVF分別為(15.1±2.1)%、(2.1±0.6)%，造模8周后分別為(21.3±2.2)%、(2.2±0.7)%，兩側(cè)造模3、8周時相比P均<0.05。

2．2 大鼠卡壓側(cè)、對照側(cè)背根神經(jīng)節(jié)Collagen Ⅰ、TGF-β1、p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白表達比較 見表1。

表1 大鼠卡壓側(cè)、對照側(cè)背根神經(jīng)節(jié)蛋白相對表達量比較

3 討論

盡管周圍神經(jīng)慢性卡壓損傷的病例普遍存在，但是想要特征性描述周圍神經(jīng)慢性卡壓損傷后的病理改變卻十分困難，有限的人體標本數(shù)量限制了進一步研究周圍神經(jīng)慢性卡壓損傷后的病理機制。本研究采用了Mackinnon設(shè)計的大鼠坐骨神經(jīng)慢性卡壓模型，該模型可以很好地模擬人類慢性神經(jīng)卡壓損傷后神經(jīng)組織的病理改變[1,6]。本實驗經(jīng)過坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌Masson染色分析發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)卡壓損傷3周后坐骨神經(jīng)支配的腓腸肌內(nèi)可觀察到膠原纖維增生，坐骨神經(jīng)卡壓損傷8周后腓腸肌內(nèi)可同時觀察到骨骼肌萎縮和膠原纖維增生。既往研究報道，周圍運動神經(jīng)損傷后支配的骨骼肌肌肉組織將發(fā)生一系列的變化，在形態(tài)學(xué)上最主要的表現(xiàn)為肌間隙纖維膠原結(jié)締組織增生導(dǎo)致的骨骼肌纖維化和骨骼肌失神經(jīng)肌萎縮[5]。因此本實驗觀察到的結(jié)果可以很好地驗證坐骨神經(jīng)慢性卡壓動物模型的可靠性和實用性，并且為下一步的研究提供良好的基礎(chǔ)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)卡壓損傷信號可以逆行向上影響背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元形態(tài)、表型及其功能[7,8]，據(jù)此筆者猜測坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷后背根神經(jīng)節(jié)可能同樣會發(fā)生某些其他改變。以膠原纖維蛋白為主的細胞外基質(zhì)合成與降解失衡調(diào)節(jié)著細胞外基質(zhì)的代謝，膠原纖維蛋白也是纖維化的重要標志物，尤其是Collagen Ⅰ的異常累積可致組織纖維化，且Collagen Ⅰ在周圍神經(jīng)組成中占膠原纖維的80%以上[9]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠坐骨神經(jīng)卡壓損傷后卡壓側(cè)較對照側(cè)背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)Collagen Ⅰ表達升高，說明坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷可以引起背根神經(jīng)節(jié)細胞外基質(zhì)沉積和纖維化形成。

TGF-β1作為公認的強致組織纖維化的細胞因子之一，參與了腎臟、肝臟、肺、心臟等器官的纖維化進程[10]。TGF-β1與其受體結(jié)合，與Smad2、Smad3和Smad4形成復(fù)合物，該復(fù)合體從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，并調(diào)節(jié)各種靶基因表達，在成纖維細胞激活、細胞外基質(zhì)沉積過程中起重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)卡壓側(cè)較對照側(cè)背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TGF-β1表達升高，推測坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷后背根神經(jīng)節(jié)細胞外基質(zhì)沉積可能與背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TGF-β1表達升高有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是大多數(shù)真核細胞內(nèi)廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是將細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細胞核內(nèi)，從而引起一系列生物學(xué)效應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)[12]。它在調(diào)控細胞生長、發(fā)育、分裂及細胞間功能的同步性等多種生理功能中起重要作用，同樣在成纖維化細胞增殖分化和組織纖維化的病理狀況下也發(fā)揮重要作用[13]。此外，MAPK通路可與TGF-β1/Smad信號通路交互調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Smad分子活性，間接影響纖維化發(fā)生發(fā)展[14, 15]。本研究發(fā)現(xiàn)卡壓側(cè)較對照側(cè)背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p-ERK蛋白表達升高，三級級聯(lián)反應(yīng)蛋白激酶Raf/MEK/ERK1/2信號通路能夠?qū)⑿盘枏哪鬟f到細胞內(nèi)能夠調(diào)節(jié)多種炎性介質(zhì)及細胞因子的表達，在成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)沉積中起著關(guān)鍵作用[16]。推測背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)成纖維細胞ERK1/2信號通路在坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷后背根神經(jīng)節(jié)細胞外基質(zhì)過度沉積和纖維化過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)TGF-β1與ERK1/2交互調(diào)節(jié)共同影響坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷后背根神經(jīng)節(jié)纖維化形成。同時本研究發(fā)現(xiàn)，卡壓側(cè)背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)p-JNK、p-p38蛋白較對照側(cè)表達降低。雖然既往研究發(fā)現(xiàn)，在成纖維細胞中，活化的JNK和p38信號通路的磷酸化水平升高參與了組織纖維化進程[17,18]，但是活化的ERK、p38和JNK在不同的細胞類型中可能通過不同的途徑發(fā)揮作用，在相同類型的細胞中，這三者在細胞周期等其他方面的功能也可能存在不同[19]。

綜上可見，大鼠坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷可以引起背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)Collagen Ⅰ上調(diào)，可能與背根神經(jīng)元內(nèi)TGF-β1表達升高有關(guān)，并且可能通過ERK信號通路激活參與背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)細胞外基質(zhì)沉積和纖維化。因此，詳細了解其涉及的分子生物學(xué)機制將可能為該類周圍神經(jīng)慢性損傷后改善感覺神經(jīng)元功能提供新的治療方向。