羅 丹，姜 敏，李柯翱，田樹革

（1.新疆師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆奇沐醫(yī)藥研究院，新疆 烏魯木齊 830013）

蟲草花屬于真菌門，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬，是由子座即草部分與菌核即蟲的尸體部分兩部分組成的復(fù)合體。其性味甘溫，入肺腎經(jīng)，有補肺腎、止喘嗽、益虛損、扶精氣之功，適用于肺腎兩虛，精氣不足，咳嗽短氣，自汗盜汗，腰膝酸軟，是一種藥食同源的菌類[1,2]。蟲草花是運用現(xiàn)代科技人工培育出來的可供人們食用的菌類新品種，市面上又稱為蛹蟲草，北冬蟲夏草，蟬花等。蟲草花的培養(yǎng)基是包含了天然蟲草花生長發(fā)育所含的各種養(yǎng)分，包括谷物類、豆類、蛋奶類等[3,4]。蟲草花中主要化學(xué)成分有氨基酸類，黃酮類，多糖類和核苷酸蟲草素等，具有抗腫瘤，抗炎鎮(zhèn)痛，抑菌抗感染，免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[5-10]。

本文以4 個不同產(chǎn)地蟲草花為對象，對其總黃酮、總氨基酸進行含量測定，探究不同產(chǎn)地蟲草花之間的品質(zhì)差異，實驗數(shù)據(jù)可以為蟲草花進一步開發(fā)利用提供相關(guān)的化學(xué)成分含量參考，并對蟲草花提取物的抗氧化活性進行了研究，以期為食用菌的開發(fā)利用提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器

K0-5200DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4 型恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；AL-04 型電子天平（德國梅特勒托利多儀器有限公司）；UV-2700 型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試藥及樣品

蘆丁標準品（批號:100080-200707，中國藥品生物制品鑒定所）；精氨酸標準品（批號:20100504，安徽宏通生物工程有限公司）；DPPH（批號:217-591-8，東京化工產(chǎn)業(yè)）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、茚三酮等試劑均為分析純；實驗室用水為蒸餾水。

蟲草花分別選自4 個產(chǎn)地，分別為新疆，云南，內(nèi)蒙古，遼寧，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為麥角菌科，蟲草屬。

1.3 樣品溶液的制備

總黃酮的提取 分別稱取4 個不同產(chǎn)地的蟲草花粉末2.00g 置于圓底燒瓶中，料液比1∶10，60%乙醇回流提取1.5h，重復(fù)兩次，過濾，合并濾液，密封保存?zhèn)溆肹11]。

總氨基酸的提取 分別稱取4 個產(chǎn)地蟲草花粉末各2.00g 置于圓底燒瓶中，料液比1∶10，加入65%乙醇回流提取2h，重復(fù)兩次，過濾，合并濾液，密封保存?zhèn)溆肹12]。

1.4 對照品溶液的制備

蘆丁標準品溶液 準確稱取5.00mg 蘆丁對照品在50mL 容量瓶并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為0.1mg·mL-1的對照品溶液，存于4℃冰箱保存。

精氨酸標準品溶液:準確稱取10.00mg 蘆丁對照品在10mL 容量瓶并用水稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度為1mg·mL-1的對照品溶液，存于4℃冰箱保存。

1.5 標準曲線建立

1.5.1 蘆丁標準曲線的測定 參照文獻[11]并做適當(dāng)修改，精密吸取蘆丁對照品溶液0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL，分別置于5 個10mL 具塞試管中，每管加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，充分搖勻，放置6min，加入0.3mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min，最后加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，并用蒸餾水補足至刻度，搖勻，室溫放置15min，以不含蘆丁標準品的溶液代替品標準品溶液做空白對照，紫外可見分光光度計于波長510nm 處測定吸光度。以蘆丁對照品溶液的濃度為橫坐標，相應(yīng)濃度下測得的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.5.2 精氨酸標準曲線的建立 參照文獻[12]并做適當(dāng)修改, 精密吸取 0.02、0.03、0.04、0.05 和 0.06mL精氨酸對照品溶液于5 支10mL 的試管中，分別加入1mL 2% 茚三酮溶液，pH 值為6.8 Na2HPO4緩沖溶液1.0mL，加蒸餾水定容至5mL，混勻，90℃水浴15min 后取出冷卻至室溫，以不含精氨酸標準品的溶液代替標準溶液作空白對照，紫外可見分光光度計于波長570nm 處測定吸光度，以精氨酸對照品溶液的濃度為橫坐標，相應(yīng)濃度下測得的吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.6 方法學(xué)考察

參考文獻[11,12]方法，取同一份標準品平行6份，在對應(yīng)最大吸收波長處測定吸光度，考察實驗精密度；同一份標準品每隔15min 測定90min 內(nèi)的吸光度值，考察實驗穩(wěn)定性；同一批次樣品平行6 份分別測定其吸光度，考察實驗重復(fù)性；平行稱取樣品6份，加入適量的標準品，按照對應(yīng)方法根據(jù)標準曲線計算出回收率和RSD 值，考察實驗的加標回收率。

1.7 樣品含量的測定

依次量取適當(dāng)?shù)南x草花提取液，根據(jù)1.5.1 和1.5.2 的方法在對應(yīng)最大吸收波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程得出樣品溶液中總黃酮的濃度，計算出4 個不同產(chǎn)地蟲草花中總黃酮、總氨基酸的含量。

1.8 蟲草花提取物對DPPH 自由基的清除實驗

參考文獻[13-15]并做改動，將蒸干的蟲草花提取物依次稀釋得到 0.4、0.32、0.28、0.4、0.2、0.016、0.08mg·mL-1濃度的溶液。樣品組:將2mL 樣品溶液及2mL 1.0×10-4DPPH 加入同一試管中，搖勻，室溫下暗處靜置30min 后在517nm 處測定吸光度（A1）；空白組:同時測定2mL DPPH 溶液與2mL 蒸餾水混合后的吸光度（A2）；空白對照:測定2mL 樣品溶液與2mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度（A3）。以VC為陽性對照，每個樣品平行測3 次。

清除率%=[1-（A1-A3）/A2]×100%

1.9 蟲草花提取物對超氧陰離子的清除實驗

參考文獻[13-15]并做改動，將蒸干的蟲草花提取物依次稀釋得到 0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1mg·mL-1濃度的溶液。A1:將 4.5mL 50mmol·L-1Tris-HCl 緩沖溶液加入試管中，25℃水浴20min，分別向試管中加入1mL 濃度梯度的樣品溶液和0.4mL 25mmol·L-1鄰苯三酚溶液，搖勻，25℃水浴 6min，加入 0.1mL 8mol·L-1的 HCl 終止反應(yīng)，在 320nm 處測定吸光度；A2:用同體積的蒸餾水代替鄰苯三酚溶液；A3:用同體積的蒸餾水代替樣品溶液。以VC 為陽性對照，每個樣品平行測3 次。

清除率%=[1-（A1-A2）/A3]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實驗 精密量取對應(yīng)的標準溶液，用1.6 方法測定標準曲線的吸光度值。實驗結(jié)果顯示，蟲草花的總黃酮、總氨基酸含量測定中其RSD 分別為1.41%、1.15%，精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性實驗 適當(dāng)吸取蟲草花樣品溶液，用1.6 方法測定標準曲線的吸光度值，在90min 里每隔15min 測定一次吸光度。結(jié)果顯示，總黃酮、總氨基酸的RSD 分別為0.39%、0.45%，表明其在90min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性實驗 稱取同一批次蟲草花樣品6份，適當(dāng)吸取蟲草花樣品溶液，用1.6 方法測定標準曲線的吸光度值，根據(jù)標準曲線計算蟲草花的總黃酮、總氨基酸的RSD 分別為0.24%、0.30%，重復(fù)性良好。

2.2.4 加標回收率（表2）

表2 加樣回收率實驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Experimental results of sample recovery rate（n=6）

由表2 可知，總黃酮、總氨基酸的加標回收率分別為:（100.41±0.56）%，（101.67±0.48）%，RSD 均小于2%，說明方法穩(wěn)定可行，實驗結(jié)果準確。

2.3 樣品含量測定

表3 不同產(chǎn)地蟲草花總黃酮、總氨基酸含量（n=3）Tab.3 Total flavonoids, total amino acid content of Cordyceps flowers from different areas（n=3）

從表3 可以看出，蟲草花總黃酮含量新疆地區(qū)最高為 5.36mg·mL-1，云南地區(qū)最低為 3.98mg·mL-1，遼寧和內(nèi)蒙古蟲草花總黃酮含量差別不大；蟲草花總氨基酸含量云南地區(qū)最高為21.88mg·mL-1，遼寧地區(qū)最低為18.99mg·mL-1，新疆，內(nèi)蒙古地區(qū)蟲草花總氨基酸含量差別不大。

2.4 蟲草花提取物對DPPH 的清除作用

按照1.8 實驗方法測定不同產(chǎn)地蟲草花提取物對DPPH 的清除作用，建立清除率-濃度曲線，見圖1。

圖1 蟲草花提取物對DPPH 的清除作用Fig.1 Effect of Cordyceps Flower on DPPH

在實驗設(shè)計的濃度范圍之內(nèi)，4 個產(chǎn)地蟲草花提取物對DPPH 自由基的清除率隨著濃度的增加而升高，具有一定的量效關(guān)系。蟲草花提取物對DPPH自由基有明顯的清除作用，新疆產(chǎn)地的蟲草花提取物對DPPH 的清除作用相較于其他3 個產(chǎn)地清除作用明顯。

2.5 蟲草花提取物對超氧陰離子的清除實驗

按照1.9 實驗方法測定不同產(chǎn)地蟲草花提取物對超氧陰離子的清除作用，建立清除率-濃度曲線，見圖2。

在實驗設(shè)計的濃度范圍之內(nèi)，蟲草花提取物對超氧陰離子的清除率隨著濃度的增加而升高，具有一定的量效關(guān)系。新疆地區(qū)蟲草花提取物對超氧陰離子清除作用相較于其他3 個地區(qū)清除作用明顯。

3 結(jié)論

蟲草花具有治療肺腎兩虛，咳嗽短氣，精氣不足，自汗盜汗等功效，其資源豐富，開發(fā)前景良好，值得深入研究。本文中對4 個不同產(chǎn)地的蟲草花進行了總黃酮、總氨基酸含量測定并評價蟲草花提取物的抗氧化活性，本實驗中方法學(xué)考察得出實驗的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均在誤差允許范圍內(nèi)，實驗結(jié)果具有可靠性。蟲草花是一種人工培育的蟲草子實體，其培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)技術(shù)、種質(zhì)資源質(zhì)量水平都會影響蟲草花的品質(zhì)。實驗結(jié)果表明不同產(chǎn)地蟲草花受氣候因素和人工培育技術(shù)影響其總黃酮、總氨基酸含量存在一定差異。同時從實驗中可以看出，蟲草花對DPPH 自由基、超氧陰離子兩種自由基具有一定的清除作用且清除率與濃度呈正相關(guān)。實驗證明，蟲草花提取物具有較強的抗氧化活性，蟲草花作為一種藥食同源的的菌類，在保健食品中應(yīng)用廣泛，本文將為蟲草花在抗氧化功能食品方面開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。