彭 敏 王大鵬 施 軍 韓耀全 雷建軍 李育森 吳偉軍 何安尤

西江流域卷口魚線粒體D-loop序列的遺傳多樣性分析*

彭 敏 王大鵬 施 軍 韓耀全 雷建軍 李育森 吳偉軍 何安尤①

(廣西遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室 廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 南寧 530021)

為研究西江流域廣西境內(nèi)卷口魚()種群的遺傳變異情況，自廣西境內(nèi)6個江段采集了139尾樣本，采用PCR與DNA測序技術(shù)分析其線粒體D-loop序列的遺傳多樣性及群體歷史動態(tài)；139條D-loop序列長度均為725 bp，堿基組成A+T (65.7%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C+G (34.3%)，共檢測到變異位點25個，轉(zhuǎn)顛換比值為11.5。139尾樣本共定義23個單倍型。單倍型的NJ系統(tǒng)樹以及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖顯示，23個單倍型間有2個明顯分支，不同地理群體來源的單倍型混雜分布在2個分支中，未能觀察到明顯的地理聚群。6個群體遺傳多樣性較好，單倍型多樣性d=0.71585~0.92063，核苷酸多樣性i=0.00173~0.00668，遺傳分化極其顯著(遺傳分化系數(shù)st=0.36737，<0.001)。AMOVA分析表明，群體內(nèi)變異占63.26%，群體間為36.74%。中性檢驗(Tajima’s= –0.50322，=0.34600；Fu’ss= –5.05210，=0.08800)與核苷酸錯配分布表明，西江流域卷口魚種群近期內(nèi)未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。綜上所述，西江流域廣西境內(nèi)的卷口魚遺傳多樣性表現(xiàn)為高單倍型、低核苷酸多樣性的特征，群體間不同程度的遺傳分化表明水壩阻隔及捕撈因素可能促進(jìn)其發(fā)生，而水利梯級開發(fā)可能是促進(jìn)卷口魚群體遺傳分化的首要原因。

卷口魚；D-loop；遺傳多樣性；遺傳分化；西江流域

卷口魚()隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、野鯪亞科(Labeoninae)、卷口魚屬()，俗稱嘉魚，其因肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美而深受消費者喜愛，經(jīng)濟(jì)價值極高，與斑鳠、鱸魚、鱖魚并稱為“珠江四大淡水名魚”。近年來，因過度捕撈和江河污染加劇，卷口魚自然資源急劇衰退，因此，其種質(zhì)資源保護(hù)和人工養(yǎng)殖越來越引起重視。

關(guān)于卷口魚的研究在21世紀(jì)初期主要集中在形態(tài)分析、年齡與生長、生理生態(tài)、人工繁殖等(崔淼等, 2001; 謝剛等, 2001; 廖顯平等, 2016; 廖國璋等, 2016; 祁寶崙等, 2001)。隨著珠江水系魚類資源日益下降，特別是梯級電站開發(fā)后，魚類種群規(guī)模與種類日趨減少(王崇等, 2015)，眾多學(xué)者的關(guān)注點開始轉(zhuǎn)向卷口魚自然種群的健康發(fā)展，即通過分子生物學(xué)的手段，檢測卷口魚的遺傳多樣性以評估該群體未來的遺傳發(fā)展趨勢，但相關(guān)研究相對較少(劉毅輝等, 2007)。杜合軍等(2006)利用RAPD技術(shù)檢測了廣西桂平至廣東肇慶之間的卷口魚群體，認(rèn)為其中至少存在2個群體；趙建(2007)采用了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和框架分析的方法對珠江水系柳江、潯江、西江3個地理群體的卷口魚的形態(tài)變異進(jìn)行分析，認(rèn)為3個江段卷口魚形態(tài)差異明顯，有一定程度的分化。范鳳娟等(2010)開展了廣西合山、柳州、桂平和廣東郁南4個地理群體卷口魚線粒體b基因的遺傳變異分析，認(rèn)為4個地理群體間無顯著的遺傳分化。眾多學(xué)者對珠江水系卷口魚的遺傳分化情況得出不同結(jié)論，可能是由于分析方法不同造成的差異，亦有可能是樣品數(shù)量較少造成的誤差。但是，現(xiàn)行捕撈強度是否對某些群體造成毀滅性打擊，梯級電站的開發(fā)是否對不同河段的卷口魚群體造成地理隔離，種群是否能持續(xù)健康的發(fā)展仍需進(jìn)行持續(xù)的調(diào)查評估。

本研究采用mtDNA D-loop序列測定的方法，對采自西江流域廣西境內(nèi)6條支流的卷口魚群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化程度和基因交流狀況分析，對廣西境內(nèi)的卷口魚野生群體遺傳狀況進(jìn)行評價，掌握其遺傳背景資料，為今后西江卷口魚的種質(zhì)資源管理、保護(hù)和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料采集

卷口魚樣本于2014年6月~2016年12月采自西江水系廣西境內(nèi)，分別為紅水河(HSH)、柳江(LIUJ)、西江(XIJ)、右江(YOUJ)、郁江(YUJ)和左江(ZJ)江段，共139尾?；铙w每尾取約5 g背部肌肉樣本，用95%酒精保存于15 ml離心管備用，每天更換1次酒精(持續(xù)2 d)。樣本數(shù)量、采樣點見表1。

表1 卷口魚D-loop遺傳多樣性指數(shù)

Tab.1 Genetic diversity parameters of P. jordani

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增與測序

取約50 mg保存肌肉于1.5 ml的EP管中，采用醋酸銨法提取卷口魚的總DNA (彭敏等, 2011)，采用微量核酸蛋白分析儀對所提DNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，DNA質(zhì)量檢測采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)檢測合格的DNA模板保存于–20℃冰箱備用。采用由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成的D-loop通用引物對卷口魚的D-loop序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為D-loop-F (5′-CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA-3′)和D-loop-R (5′-GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA-3′) (Xiao, 2001)。

PCR反應(yīng)體系50.0 μl，包括2×ExMaster Mix 25 μl，10 μmol/L的上、下游引物各2 μl，250 ng/μl DNA模板2.0 μl，用ddH2O補至50.0 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，共進(jìn)行35次循環(huán)。

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至深圳華大基因公司進(jìn)行正反2次重復(fù)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 4.1軟件中的ClustalW程序并輔以人工校對去除序列兩端不穩(wěn)定部分，分析序列堿基含量及變異位點，利用該軟件的Kimura 2-parameter模型計算遺傳距離，并以大眼卷口魚()(GenBank登錄號：MF457481.1)作為外類群，構(gòu)建單倍型的NJ系統(tǒng)樹(金逍逍等, 2013)。單倍型及遺傳多樣性參數(shù)使用DnsSP 5.10軟件(Librado, 2009)統(tǒng)計。采用Arlequin 3.5軟件(Excoffier, 2010)進(jìn)行分子方差分析、評估種群的遺傳分化，并進(jìn)行Tajima’s和Fu′ss中性檢驗以及核苷酸不配對分布；用Network 4.0軟件(Bandelt, 1999)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷口魚線粒體D-loop堿基組成及突變類型

2.1.1 堿基組成 6個卷口魚群體的139條D-loop序列(去除序列兩端不穩(wěn)定部分)忽略插入、缺失時長度均為725 bp，堿基T、C、A和G的平均含量分別為34.6%、20.1%、31.0%和14.2%，其中，A+T (65.7%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C+G (34.3%)，表現(xiàn)出較強的堿基偏倚性，與脊椎動物線粒體DNA序列特征類似。其中，本研究所獲得的卷口魚23個單倍型序列已上傳至GenBank (登錄號：MN093128-MN093150)。

2.1.2 突變類型 139尾卷口魚D-loop序列共檢測出變異位點25個，占總位點數(shù)的3.45%，其中，簡約信息位點19個，單一變異位點6個，共檢測到1個插入或缺失位點。其中，紅水河群體變異位點最多，共17個；其次為右江和郁江群體，為11個；柳江和西江群體變異位點最少，均為5個(表1)。轉(zhuǎn)顛換比值為11.5，其中，23個為轉(zhuǎn)換，2個為顛換。

2.2 卷口魚線粒體D-loop的遺傳多樣性

2.2.1 群體間遺傳多樣性差異 將6個不同地理群體設(shè)置為同一組群，單倍型多樣性d=0.91263，核苷酸多樣性i=0.00517。群體間的d=0.71585~ 0.92063，其中，紅水河群體最高(0.92063)，其次為西江群體(0.88889)，最低為柳江群體(0.71585)；群體間i=0.00173~0.00668，與單倍型多樣性表現(xiàn)相一致。平均核苷酸差異以紅水河群體最高，為4.83333，最低為柳江群體，為1.25366。遺傳多樣性各指數(shù)均以紅水河最好，柳江最差(表1)。

2.2.2 NJ系統(tǒng)樹與單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) 單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖1)和NJ系統(tǒng)樹(圖2)表現(xiàn)出較高的一致性。139尾個體擁有23個單倍型，主要分為2大支(Ⅰ和Ⅱ)，分支Ⅱ僅由紅水河群體大半個體和右江群體的3個個體構(gòu)成，其余個體構(gòu)成分支Ⅰ。hap13為優(yōu)勢單倍型，由23尾個體共享，占總個體數(shù)的16.55%，主要分布于柳江、右江、郁江和左江群體；hap14僅分布于柳江和西江群體，有21尾個體，占總個體數(shù)的15.11%。單倍型豐度最多的為紅水河群體，擁有12個單倍型；其次為郁江群體，擁有8個單倍型；柳江與西江群體均擁有6個單倍型；左江與右江群體有5個單倍型。共有13個單倍型為不同群體獨享，其中，紅水河群體獨享7個，郁江群體4個，左江群體2個，右江群體1個，柳江與西江群體均無獨享單倍型。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和NJ系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)顯示，不同地理群體個體的單倍型分布混雜，未能觀察到明顯的地理聚群。

圖1 卷口魚單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

圓面積代表單倍型出現(xiàn)的頻率，彩色扇形代表各群體在同一單倍型中所占的比例，空圈代表未發(fā)現(xiàn)或已經(jīng)滅絕的單倍型

Circle portion represents the frequencies of haplotype, and the colored portion represents the percentage of the same haplotype in each populations, the empty circles represents the haplotypes which were not found or extinct

圖2 卷口魚單倍型系統(tǒng)樹

2.3 卷口魚的遺傳分化

利用MEGA 4.1軟件分析結(jié)果如表2所示：紅水河群體和左江、郁江群體間的遺傳距離最遠(yuǎn)，均為0.00863；遺傳距離最近的是西江群體和柳江群體(0.00210)。群體內(nèi)遺傳距離由大到小依次為為紅水河群體(0.00673)>右江(0.00513)>郁江(0.00329)>西江(0.00228)>左江(0.00233)>柳江(0.00174)。依據(jù)NJ系統(tǒng)樹劃分的2大分支計算，分支Ⅰ遺傳距離為0.003120，分支Ⅱ遺傳距離為0.004869，2分支間遺傳距離為0.010280。

群體間F=0.05533~0.58351，除了左江與郁江、右江群體外，其余群體間均存在顯著的遺傳分化(< 0.05)，左江與柳江群體的遺傳分化程度最大(0.52351)，與郁江群體間的遺傳分化程度最小(0.05533)。

AMOVA分析(表3)發(fā)現(xiàn)，各地理群體間存在極顯著的遺傳分化(F=0.36737，<0.01)。群體間變異占36.74%，群體內(nèi)變異占63.26%，變異大部分來自群體內(nèi)部，基因流m=0.430513。按圖2將所有個體劃分為2個譜系，分支間仍存在極顯著的遺傳分化(F=0.69318，<0.01)，其中，分支間變異占69.32%，分支內(nèi)變異占30.68%，基因流m=0.221313，表明 2分支間基因交流處于較低水平。

2.4 群體動態(tài)分析

核苷酸錯配分布(圖3)及Tajima's和Fu′ss的檢驗(表4)結(jié)果如下：Fu’ss檢驗(Fu’ss=–5.05210,=0.08800)和Tajima’s(Tajima’s=–0.50322,= 0.34600)檢驗均為不顯著負(fù)值(>0.05)，核苷酸錯配分布為雙峰，表明西江水系卷口魚基于D-loop序列的群體動態(tài)分析支持西江水系卷口魚未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。各江段分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除西江群體Fu'ss檢驗為顯著負(fù)值外(=0.031)，其他為不顯著負(fù)值或正值(>0.05)，表明除西江群體可能發(fā)生過種群擴(kuò)張外，其他江段并無種群擴(kuò)張跡象。

表2 卷口魚遺傳距離與遺傳分化系數(shù)(st)

Tab.2 Genetic distance and genetic differentiation coefficient (Fst) of P. jordani

注：對角線為群體內(nèi)遺傳距離；對角線下方表示群體間遺傳距離；對角線上方表示st值?！?*”表示<0.01, “*”表示<0.05

Note: The diagonal is the genetic distance within the population; and below the diagonal is the genetic distance between the populations; above the diagonal is the genetic differentiation coefficient (st). **:<0.01; *:<0.05

表3 AMOVA分析

Tab.3 Analysis of molecular variances (AMOVA)

**:<0.01

表4 卷口魚D-loop序列Tajima′s和Tajima′s檢驗

Tab.4 Tajima′s D and Tajima′s D test of P. jordani mtRNA D-loop

圖3 卷口魚核苷酸錯配分布

3 討論

3.1 卷口魚的遺傳多樣性

遺傳多樣性通常是物種長期進(jìn)化的結(jié)果，是物種或其群體持續(xù)生存并適應(yīng)不斷變化的環(huán)境而進(jìn)化的前提。通常物種的遺傳多樣性或變異性越豐富，則表明該物種的進(jìn)化潛力越大，對環(huán)境改變響應(yīng)的進(jìn)化能力就越強(Laikre, 2005; 宋娜等, 2018)。遺傳多樣性大小決定該生物能否繼續(xù)在生物圈繁衍和生活，多樣性下降將會對種群的健康發(fā)展產(chǎn)生負(fù)面影響(Ryman, 1987; 姜艷艷等, 2003; 楊子拓, 2016)。單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)通常被用于評估生物遺傳多樣性(Vrijenhoek, 1994; 李大命等, 2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，西江流域廣西境內(nèi)6個地理群體的卷口魚多樣性指數(shù)d=0.91260，i=0.00517。與同樣基于D-loop序列為分子標(biāo)記分析的同一流域的其他鯉科魚類相比，高于位于可渡河的光唇裂腹魚()種群(d=0.733，i=0.0027) (韓虎峰等, 2010)，低于赤眼鱒()種群(d=0.978，i=0.00791)(陳方燦等, 2015; 李潮等, 2018)和大眼華鳊()群體(d=0.91600，i=0.01569)；與翹嘴鲌()群體(d= 0.87506,i=0.0070)，和大眼近紅鲌()群體(d=0.847，i=0.00693)相比，具有更高的單倍型多樣性與較低的核苷酸多樣性(楊子拓等, 2016; 楊子拓, 2016)。本研究中，各群體的遺傳多樣性差異較大，除了紅水河與右江群體，其他各江段的遺傳多樣性仍相對較低。西江流域廣西境內(nèi)多個江段卷口魚群體呈現(xiàn)出高單倍型和低核苷酸多樣性特征，可能是種群發(fā)生瓶頸效應(yīng)后快速增長，使得單倍型的豐度提高，但時間不足以提高核苷酸多樣性所造成(Grant, 1998)。

3.2 卷口魚的遺傳分化

群體間的遺傳距離是物種分類的一個重要依據(jù)。遺傳距離越大表明群體間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)(張鶴千等, 2015)。本研究中，各群體間遺傳距離為0.00210~ 0.00863，各群體內(nèi)的遺傳距離為0.00228~0.00673，無明顯差異，表明該6個群體間具有較近的親緣關(guān)系。單倍型的NJ系統(tǒng)樹和網(wǎng)絡(luò)圖顯示，本次采樣的6個不同地理群體個體來源的單倍型分布混雜，未能觀察到明顯的地理聚群。但按NJ系統(tǒng)樹劃分的兩分支間存在顯著較高的遺傳分化(st=0.69318，<0.01)。

群體遺傳學(xué)認(rèn)為，st是測量群體間遺傳分化的重要參數(shù)，st值越大表明分化程度較高(Wright, 1979; 沈朕等, 2017)。Wright(1965)提出遺傳分化標(biāo)準(zhǔn)(st<0.05，無遺傳分化；0.050.25，遺傳分化較大)。研究表明，柳江與西江、右江與郁江/左江、郁江與左江群體之間的遺傳分化值為0.05~0.15，遺傳分化較?。患t水河與右江間的遺傳分化值為0.15~0.25，為中度遺傳分化；而紅水河與柳江/西江/郁江/左江、柳江與右江/郁江/左江、西江與右江/郁江/左江間st>0.25，遺傳分化較大，地理隔離造成群體間基因交流減少可能是造成該結(jié)果的原因之一。如左江、右江是郁江、西江的上游，群體間遺傳距離均小于0.00500，其主要受水壩阻隔的影響；又如紅水河與郁江、右江群體的遺傳距離均大于0.00500，因受大壩阻隔與不同支流的雙重影響，遺傳距離遠(yuǎn)大于前者，水壩阻隔與不同支流間的地理阻礙使基因交流更加困難，相應(yīng)分化程度就越高，而紅水河與其他群體遺傳距離較遠(yuǎn)，可能與紅水河過于密集的梯級開發(fā)程度有關(guān)。在2010年的調(diào)查中，紅水河干流11個梯級中有10個已建或在建(薛聯(lián)芳等, 2010)?？锾煨竦?2018)在對珠江鯽()遺傳種質(zhì)資源分析中亦發(fā)現(xiàn)，大量的水利開發(fā)可能是導(dǎo)致遺傳多樣性差異分布的原因之一。

3.3 西江流域卷口魚的歷史動態(tài)

Tajima(1989)認(rèn)為，如果Tajima’s與Fu’ss值呈負(fù)值，且在統(tǒng)計學(xué)上達(dá)到顯著標(biāo)準(zhǔn)，則說明序列中含有比中性進(jìn)化模型更多的核苷酸位點變化，可能預(yù)示著被研究種群曾經(jīng)歷過一個擴(kuò)張的歷史。同一組群AMOVA分析及核苷酸錯配分布圖表明，F(xiàn)u’ss檢驗(Fu’ss=–5.05210，=0.08800)和Tajima’s(Tajima's=–0.50322，=0.34600)檢驗均為不顯著負(fù)值，核苷酸錯配分布為雙峰。結(jié)果支持西江流域卷口魚未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。

3.4 西江流域卷口魚的種質(zhì)資源保護(hù)

魚類作為水域生態(tài)系統(tǒng)的消費者，在水域環(huán)境中處于食物鏈的末端，對維護(hù)水域生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動具有重要作用，任何水環(huán)境污染及水利工程開發(fā)等都有可能對魚類群體的健康發(fā)展造成不良影響，從而影響水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及正常運行。西江流域廣西境內(nèi)的卷口魚群體仍保持著較好的遺傳多樣性，但部分群體間遺傳分化程度較大，水壩阻隔和捕撈因素可能促進(jìn)了卷口魚的遺傳分化，其中，以紅水河水利梯級開發(fā)對卷口魚的基因交流造成的影響更為明顯。建議加強對卷口魚以及西江流域其他土著魚類遺傳多樣性的監(jiān)控；水電大壩合理設(shè)置過魚設(shè)施以促進(jìn)各江段群體間遷移；適當(dāng)引入同一流域不同江段的親魚進(jìn)行人工繁育以獲得雜合度更高的子代，并通過增殖放流增進(jìn)各江段群體間基因交流，以此彌補因地理阻隔造成的基因缺失。

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Genetic Diversity Analysis of Mitochondrial D-loop Sequence ofin Xijiang River Basin

PENG Min, WANG Dapeng, SHI Jun, HAN Yaoquan, LEI Jianjun, LI Yusen, WU Weijun, HE Anyou①

(Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture, Guangxi Academy of Fishery Sciences, Nanning 530021)

To study the genetic diversity and genetic differentiation of apopulation in the Xijiang River Basin, Guangxi Province, China, mitochondrial D-loop sequences from six rivers were subjected to polymer chain reaction and DNA sequencing analysis. The A+T base composition was much higher (65.7%) than the C+G combination (34.3%) in 139 individuals, which have a D-loop sequence length of 725 bp, and a transversion ratioof 11.5. Twenty-five polymorphic sites were defined. An NJ system tree of haplotypes and network structure diagram revealed two distinct branches among 23 haplotypes but no obvious geographic clusters, because the haplotypes from different geographic groups were mixed in two branches. Individuals from six different geographic populations had superior genetic diversity (d=0.71585~0.92063,i=0.00173~0.00668) and extremely significant genetic differentiation (st=0.36737,<0.001). Analysis of molecular variance indicated that most of the variation was intragroup (63.26%). The results of a neutrality test (Tajima’s= –0.50322,-value=0.34600; Fu’sF= –5.05210,-value=0.08800) and nucleotide mismatch distribution showed that the population ofin the Xijiang River Basin had not experienced a population expansion in recent years. The genetic diversity of thein the Xijiang River Basin exhibited high haplotype and low nucleotide diversity. Various degrees of genetic differentiation intergroups indicate that a dam barrier and fishing factors may be contributing to their occurrence, and a cascade development of water resources may be the primary cause of population genetic differentiation of.

; D-loop; Genetic diversity; Genetic differentiation; Xijiang River Basin

HE Anyou, E-mail: 919384987@qq.com

Q319.1

A

2095-9869(2020)05-0004-08

10.19663/j.issn2095-9869.20190527002

http://www.yykxjz.cn/

彭敏, 王大鵬, 施軍, 韓耀全, 雷建軍, 李育森, 吳偉軍, 何安尤. 西江流域卷口魚線粒體D-loop序列的遺傳多樣性分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(5): 30–37

Peng M, Wang DP, Shi J, Han YQ, Lei JJ, Li YS, Wu WJ, He AY. Genetic diversity analysis of mitochondrial D-loop sequence ofin Xijiang River Basin. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 30–37

* 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303048)和廣西自然科學(xué)基金重大項目(2013GXNSFEA053003)共同資助 [This work was supported by Public Welfare Industry (Agriculture) Research Project (201303048), and Major Project of Guangxi Natural Science Foundation (2013GXNSFEA053003)]. 彭 敏, E-mail: gxnnpm@126.com

何安尤，高級工程師，E-mail：919384987@qq.com

2019-05-27,

2019-07-23

(編輯 馮小花)