李 澤, 江鈞益,王淑輝,孫秀柱, 魏澤輝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

雌性哺乳動(dòng)物的生育能力與卵巢卵泡的生長發(fā)育和閉鎖緊密相關(guān)。而顆粒細(xì)胞(Granulosa cells, GCs)作為卵泡的重要組成，主要負(fù)責(zé)類固醇激素和調(diào)節(jié)因子的合成并為卵母細(xì)胞生長提供營養(yǎng)等[1-2]。因此，顆粒細(xì)胞的增殖，分化和凋亡是卵泡發(fā)育過程中的關(guān)鍵事件[3]。在哺乳動(dòng)物的卵巢中，其生理調(diào)控過程涉及到多種細(xì)胞因子和信號通路。尤其是，卵泡的形成和閉鎖過程受到一系列自分泌和旁分泌因子的調(diào)控[5-6]。microRNA(miRNA)作為一種短的非編碼RNA，通過影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯廣泛參與卵泡的發(fā)育、成熟以及卵巢激素合成和分泌等多種生物學(xué)過程，維持卵巢的正常生長發(fā)育及其功能的發(fā)揮。在正常細(xì)胞中，miRNA維持著關(guān)鍵細(xì)胞過程的平衡，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。同時(shí)，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的進(jìn)展有關(guān)[7]。據(jù)報(bào)道，miR-18b與乳腺癌有關(guān)[8]，且循環(huán)系統(tǒng)中的miR-18b的升高可作為乳腺癌的潛在標(biāo)志物[9]。另外，多囊卵巢綜合征(Polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者血清中miR-18b的表達(dá)增加[10]。而miR-18b在先兆子癇(Preeclampsia，PE)胎盤中表現(xiàn)出病理性低表達(dá)水平[11]。越來越多的證據(jù)表明，miR-18b在包括生殖系統(tǒng)疾病在內(nèi)的人類疾病的發(fā)展中起著重要作用。但是，miR-18b的生物學(xué)作用及其可能的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究以兔卵巢顆粒細(xì)胞為對象，主要通過生物信息學(xué)方法對miR-18b進(jìn)行功能預(yù)測分析，并進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測來驗(yàn)證miR-18b對CDK19(Cyclin dependent kinase 19)基因的靶向關(guān)系，為進(jìn)一步研究miR-18b在卵巢卵泡發(fā)育中的作用提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測 ocu-miR-18b 的靶基因及其可能參與的生物學(xué)過程。首先，通過 miRbase 數(shù)據(jù)庫獲取兔、人、小鼠、大鼠、獼猴、負(fù)鼠和倉鼠七個(gè)物種的miR-18b成熟序列，并分析物種間保守性。然后，應(yīng)用 miRWalk、miRanda、ENCORI 三種軟件對 ocu-miR-18b 進(jìn)行靶基因預(yù)測并取交集得到文氏圖。接下來通過David Bioinformatic resources 6.8 在線軟件進(jìn)行功能注釋(GO分析) 和 pathway信號通路富集分析，以P<0.05為顯著性閾值，得到GO類別上的高頻率注釋及有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號通路。P值越小代表富集性越顯著。利用R軟件制作數(shù)據(jù)可視化散點(diǎn)圖。

1.2 組織和細(xì)胞

成年健康母兔的卵巢組織來自陜西省咸陽市楊凌區(qū)某兔場，將新鮮摘除的卵巢置于含雙抗的生理鹽水中，并于3 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；HEK293T 細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.3 兔顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將成年兔卵巢浸泡在37 ℃預(yù)熱的含1%青霉素-鏈霉素的生理鹽水中。去除卵巢周圍的脂肪組織后，用針刺破卵泡，使卵泡液流出，將細(xì)胞收集在含有10%FBS，1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃的5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。

取出用新培養(yǎng)基清洗兩次，以去除血液和未附著的細(xì)胞。將兔顆粒細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的量接種在6孔細(xì)胞板上。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到大約70%匯合度時(shí)，使用脂質(zhì)體2000 (LipofectamineTM2000) (Thermo Fisher)，分別用50 nM miR-18b模擬物 (Mimics)，50 nM模擬陰性對照物 (Mimic negative control, mimcs NC)，100 nM miR-18b抑制劑 (Inhibitor) 或100nM抑制劑陰性對照 (Inhibitor negative control, NC) 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 RNA提取，反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用Trizol (Life Technologies) 從顆粒細(xì)胞中分離總RNA。用NanoDrop 2000(Thermo)測定總RNA的濃度。根據(jù)miRNA cDNA合成試劑盒說明書，對每個(gè)樣品中的1 μg RNA進(jìn)行定量的特異性逆轉(zhuǎn)錄(Takara，日本)。使用SYBR Premix Ex TaqTMII(中國南京，Vazyme)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，分別檢測mRNA和miRNA的表達(dá)。表1列出了所使用的基因特異性引物。用于檢測mRNA的PCR循環(huán)條件為：在95 ℃下30s，60 ℃ 30s和72 ℃ 30s的40個(gè)循環(huán)。用于miRNA檢測的PCR循環(huán)條件是：在95 ℃下持續(xù)15s，在60 ℃下持續(xù)1min的40個(gè)循環(huán)。使用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法(分別以β-actin和U6 snRNA作為內(nèi)源參照)定量mRNA和miRNA的相對表達(dá)。

表1 熒光定量 PCR 引物Table 1 Summary of specific primers for Real-time PCR

1.5 雙熒光素酶活性檢測

根據(jù)GenBank中的兔CDK19 3'UTR序列設(shè)計(jì)并合成了具有推測的miR-18b結(jié)合位點(diǎn)的退火寡核苷酸對。將雙鏈產(chǎn)物插入熒光素酶基因下游的pmiR-RB-REPORT TM雙熒光素酶報(bào)告載體 ( Ribobio，中國廣州) 。使用12孔板中培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞，用測序鑒定后的3' UTR野生型(WT)或CDK19 3' UTR突變型(對種子序列中的6個(gè)堿基進(jìn)行點(diǎn)突變)(Mut)報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-18b mimics或mimics NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h。參照Dual-Luciferase reporter assay system試劑盒(Promega公司)的說明書步驟進(jìn)行操作，并使用酶標(biāo)儀(Bio Rad生物工程有限公司)進(jìn)行熒光素酶活性的測定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用 GraphPad Prism 7 ( GraphPad Software Inc, San Diego, CA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較用t檢驗(yàn)。所有結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 保守性分析 miRBase數(shù)據(jù)庫中下載的人、小鼠、大鼠、獼猴、負(fù)鼠和倉鼠的miR-18b成熟序列與兔miR-18b序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)miR-18b的成熟序列在各物種間高度保守(表2)。

表2 不同物種miR-18b成熟序列Table 2 Mature sequences of mir-18b in different species

2.1.2 靶基因預(yù)測 用miRWalk、ENCORI、miRanda 分別預(yù)測到 2398、2826、7306個(gè)miR-18b的靶基因，取三者的交集，獲得 332個(gè)靶基因(圖 1)。

2.1.3 靶基因預(yù)測GO分析 針對332個(gè)靶基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)注釋分類和富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-18b的預(yù)測靶基因在生物學(xué)過程(Biological process, BP)層面上顯著富集在細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、BMP信號通路的正調(diào)控、髓鞘形成、神經(jīng)管形成、神經(jīng)肌肉接頭發(fā)育、原腸(胚)形成的調(diào)節(jié)和外在凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控等條目中(P<0.05)；在分子功能(Molecular Function, MF)層面，靶基因顯著富集在泛素蛋白連接酶、受體信號蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶、ATP酶活性、轉(zhuǎn)錄激活子等的活性調(diào)控，和RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)域序列特異性結(jié)合等條目中(P<0.05)；在細(xì)胞成分(Cell Component, CC)層面，靶基因主要富集在肌動(dòng)蛋白絲、核質(zhì)、粘著斑、高爾基體、膜的外在成分、髓鞘等條目中(P<0.05)(圖2)。

2.1.4 miR-18b靶基因集合的KEGG通路分析 KEGG分析結(jié)果顯示，miR-18b 的靶基因集合顯著富集于胞吞作用、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性、癌癥中的MicroRNA、癌癥的途徑、胰腺癌、TGF-β、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、膀胱癌和PI3K-Akt等信號通路(P<0.05)(圖 3)。這些信號通路在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

2.2 miR-18b特異性結(jié)合CDK19

由于miR-18b預(yù)測的靶基因顯著富集于細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控，BMP信號通路的正調(diào)控及致癌作用等信號通路，因此我們推測miR-18b可能在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。所以推斷CDK19是miR-18b的重要靶基因，影響著顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，并在兔卵巢顆粒細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系。

首先進(jìn)行野生型(wt)和突變型(mt)載體的構(gòu)建，然后將兩組質(zhì)粒載體分別與 miR-18b的mimics或mimics NC共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，檢測雙熒光素酶活性。結(jié)果顯示，wt+mimics組與wt+mimics NC組的雙熒光素酶活性相比顯著降低，而mt組的活性無顯著差異。證明miR-18b與CDK19 3' UTR有直接靶向關(guān)系。然后，在兔卵巢顆粒細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染 miR-18b的mimics，mimics NC，inhibitor及inhibitor NC后，利用qRT-PCR檢測 miR-18b 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，miR-18b的超表達(dá)效率及抑制效率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4C)。再利用qRT-PCR檢測CDK19在兔卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)miR-18b與CDK19表達(dá)模式恰好相反(P<0.05，圖4D)。最終結(jié)果表明，CDK19是miR-18b的靶基因。

3 討 論

對雌性動(dòng)物而言，卵巢是卵母細(xì)胞生長發(fā)育和排卵的重要場所。從原始卵泡生長啟動(dòng)、增殖、分化、閉鎖/排卵到黃體形成，顆粒細(xì)胞在形態(tài)、功能等方面都發(fā)生各種變化。卵巢顆粒細(xì)胞狀態(tài)(凋亡或增殖)決定卵泡發(fā)育的命運(yùn)(閉鎖或排卵)[12-13]。而miRNA-18b，作為卵巢卵泡發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，在顆粒細(xì)胞凋亡(卵泡閉鎖)中發(fā)揮重要作用[9-10]。近年來，miRNAs的失調(diào)被認(rèn)為與許多疾病存在互為因果的關(guān)系。在疾病的早期它可以提供一些有價(jià)值的信息以預(yù)防疾病傳播及進(jìn)行疾病診斷[14]。通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miRNA 的靶基因，與已經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因集進(jìn)行生物功能富集分析和信號通路富集分析，可為進(jìn)一步研究 miRNA 提供引導(dǎo)方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-18b預(yù)測到的靶基因富集在抑制細(xì)胞凋亡的信號通路，此外還包括TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子，transforming growth factor-β)超家族中的BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白，bone morphogenetic protein)信號通路的正調(diào)控等生物學(xué)過程；調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)降解等分子功能；TGF-β，PI3K-Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B，phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) / protein kinase B (AKT))等信號通路?？傊?，miR-18b可能對細(xì)胞周期調(diào)控，抑制細(xì)胞增殖更新，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等過程具有重要的作用[15-18]。其中，關(guān)鍵靶基因CDK19，具有復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，并且對細(xì)胞的增殖凋亡起到調(diào)節(jié)作用，并且與癌癥發(fā)生息息相關(guān)。例如，CDK19在前列腺癌中特異性表達(dá)，且與癌細(xì)胞的侵襲性有關(guān)[19]。并且CDK19能維持前列腺癌細(xì)胞G1/S的正常轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。Nitulescu等[21]證明，CDK19能促進(jìn)急性髓系白血病細(xì)胞的增殖和分化。通過實(shí)驗(yàn)研究，CDK19的抑制劑對抑制白血病細(xì)胞增殖、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移性或腫瘤對抗癌藥物的反應(yīng)具有潛在的良性作用[22]。更為重要的是，McDermott等[23]發(fā)現(xiàn)，抑制或敲除CDK19能夠抑制雌激素誘導(dǎo)的雌激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄；這種效應(yīng)在雌激素受體的下游發(fā)揮作用。Porter等[24]分析表明，CDK19在乳腺癌和卵巢癌中的高度表達(dá)與不良的預(yù)后狀況密切相關(guān)。CDK19可能與卵巢的發(fā)育和卵泡生長密切相關(guān)。

miRNA可以作為CDK19重要的調(diào)節(jié)因子，參與體內(nèi)的生理代謝活動(dòng)。如在胰腺祖細(xì)胞中，miR-18a靶向CDK19抑制其表達(dá)，從而抑制胰腺祖細(xì)胞的增殖[25]；在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，CDK19的表達(dá)可被miR-18a-5p，miR-383等負(fù)調(diào)控[26]。在腎細(xì)胞癌中，過表達(dá)miR-15可顯著降低CDK 19的表達(dá)水平[27]。本研究中，過表達(dá)miR-18b后，兔卵巢顆粒細(xì)胞中CDK19的表達(dá)受到了顯著抑制，但關(guān)于其具體的調(diào)控作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

總之，miR-18b預(yù)測的靶基因富集的數(shù)據(jù)突出了miR-18b在抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡中的潛在作用。并進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證了CDK19和ocu-miR-18b的靶向關(guān)系；在兔卵巢顆粒細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-18b與CDK19表達(dá)模式恰好相反，證實(shí)了其作用方式。在后續(xù)研究中，以確證miR-18b對卵巢顆粒細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，這將進(jìn)一步擴(kuò)展miR-18b的分子機(jī)制，這對進(jìn)一步了解卵巢顆粒細(xì)胞miRNA對卵泡發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，提高畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。