李晴晴 王妍 劉燦 唐藝榕

目的：探討桑葉提取物DNJ對高脂飲食誘導的肥胖小鼠的抗肥胖作用。

方法：建立C57/BL小鼠鼠肥胖癥模型，給藥不同劑量DNJ干預。

實驗分組為：空白對照組，HFD模型組，給藥低劑量DNJ（50mg·kg-1·d-1）組，給藥高劑量DNJ（100mg·kg-1·d-1）組。檢測小鼠體重、附睪白色脂肪、肩胛棕色脂肪重量；白色脂肪HE染色觀察形態(tài)學變化；檢測棕色脂肪組織UCP1 和 PRDM16 表達。

結(jié)果：（1）DNJ抑制HFD肥胖小鼠體重增加，改善由高脂飲食導致的白色脂肪組織過量積累，增加棕色脂肪量；（2）DNJ能夠改善因高脂飲食而造成的附睪脂肪組織細胞增大。（3）DNJ能夠棕色脂肪特異性基因的表達，提高HFD小鼠棕色脂肪活性。

結(jié)論：桑葉提取物DNJ對HFD小鼠具有抗肥胖的作用，其抗肥胖作用可能與增強棕色脂肪活性有關。

關鍵詞：肥胖；DNJ；白色脂肪； 棕色脂肪

隨著社會的發(fā)展與人們生活方式的改變，超重和肥胖人群逐漸增多。大量研究表明，肥胖已成為糖尿病、高脂血癥、高血壓等疾病的危險因素。對于肥胖的預防與治療手段主要包括飲食控制、藥物治療和手術(shù)治療等。哺乳動物體內(nèi)主要存在兩種脂肪，白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪以儲能為主，分化異?；蜻^度堆積誘發(fā)肥胖。棕色脂肪產(chǎn)熱耗能，起到保暖及維持機體熱平衡的作用，增強機體棕色脂肪活性可有效對抗肥胖。

桑葉是傳統(tǒng)中醫(yī)治療常用的中藥材，富含多種活性物質(zhì)，如：黃酮、生物堿、多糖、氨基酸及多種維生素、微量元素等，具有降血糖、調(diào)血脂、抗炎抗氧化的功效。1-脫氧野尻霉（1-Deoxynojirimycin， DNJ）是從桑葉中分離出的一個哌啶類多羥基生物堿。關于桑葉的研究多集中在降血糖及其機理方面，對肥胖的治療作用鮮有報道。本課題以高脂飼料誘導的肥胖模型小鼠為實驗動物，給藥DNJ，探討其對肥胖的治療作用，為充分開發(fā)利用桑葉DNJ的生物活性功能提供理論依據(jù)。

1. 材料

1.1 實驗動物

C57/BL 雄性小鼠，4周齡，SPF級，購自湖南斯萊克實驗動物有限公司，體重（15-20）g（質(zhì)量合格證號：NO.4845700029），購入后飼養(yǎng)于長沙醫(yī)學院動物實驗中心。標準環(huán)境喂養(yǎng)（室溫：22±2℃；相對濕度：55%±10%），光照為12小時/天，給予小鼠自由飲水和飲食。

1.2 試劑

DNJ（純度98%，北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司）， 膽固醇、膽酸鈉（美國Amresco公司），蛋黃粉（瑞士雀巢食品公司）。普通飼料購自長沙醫(yī)學院動物實驗中心。甲醛溶液（福爾馬林，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；石蠟 （湖南明瑞科技有限公司），二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司），HE染色試劑盒（南京雨露生物有限公司）。UCP1、PRDM16單克隆抗體，β-actin單克隆抗體購自美國SantaCruz公司。UCP1、PRDM16引物由上海生工生物有限公司設計并合成。蛋白提取試劑（碧云天生物公司），RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Real-time PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

2. 方法

2.1 小鼠肥胖模型的建立

C57/BL小鼠45只，普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組（n=10）和造模組（n=35）。空白對照組普通飼料喂養(yǎng)，造模型組高脂飼料（基礎飼料78.9%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%，膽酸鈉鹽0.1%）飼養(yǎng)。自由飲食飲水，保持通風，相對濕度為55%±10%，溫度為（22±2）℃，晝夜節(jié)律照明。連續(xù)飼養(yǎng)8周，體重增加20%以上的小鼠即為肥胖模型小鼠。

2.2 實驗分組

C57/BL肥胖模型小鼠33只隨機分為3組：肥胖模型組（HFD組），DNJ低劑量組（50mg/kg/d），DNJ高劑量（100mg/kg/d），灌胃給藥，連續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束禁食12 h后處理。

2.3 指標檢測

2.3.1 脂肪組織收集

所有動物處理前禁食過夜，稱重，10%水合氯醛腹腔注射（100μL/10g） 麻醉，收集動物睪丸周圍白色脂肪組織、肩胛部位棕色脂肪，準確稱重。取少量新鮮附睪脂肪，用10%甲醛溶液固定，其余組織經(jīng)液氮快速冷凍后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 附睪脂肪組織HE染色

經(jīng)10%甲醛溶液固定24h的脂肪組織，逐級脫水、透明、浸臘、包埋、切片，HE染色后，于高分辨率顯微鏡下觀察并拍照。

2.3.3 Real-time PCR棕色脂肪組織中UCP1、PRDM16 mRNA表達

取棕色脂肪組織，每100mg組織加入約1ml裂解液充分裂解，并進行液氮冰浴研磨處理。將研磨后的組織震蕩混勻，室溫靜置后，4℃12000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液EP管中提取RNA。

將提取好的RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋25倍，以2μL cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，熒光定量PCR儀進行PCR擴增基因片斷反應，通過△△Ct值相對定量UCP1、PRDM16mRNA表達。引物序列表如表1所示。

2.3.4 Western blot 法檢測 UCP1 和PRDM16 表達

取棕色脂肪勻漿后，4℃條件下，12000rpm離心10min，上清分裝轉(zhuǎn)移至0.5mL的離心管中。加入適量的含0.1%PMSF（蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟）的Western IP裂解液冰浴裂解30min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入SDS上樣緩沖液，99℃變性10min。每組以含總蛋白40g上樣，電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上用5%脫脂奶粉封閉1h，然后與一抗于4℃孵育過夜，用TBST洗滌后， 再與二抗孵育1h，用TBST洗滌后顯影并定量分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。差異顯著水平為 P< 0.05。

3. 實驗結(jié)果

3.1 DNJ抑制HFD肥胖小鼠體重的增加

為研究桑葉提取物DNJ的抗肥胖作用，本實驗用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠建立肥胖模型。與普通飼料喂養(yǎng)的Control 組小鼠比較，高脂飼料飼養(yǎng)8周后模型組小鼠體重增加34.6%。 對造模成功的HFD肥胖小鼠，給藥不同劑量DNJ治療4周后，結(jié)果如圖1顯示：與肥胖模型組小鼠相比：低劑量DNJ組（50mg/kg/d）、高劑量DNJ組（50mg/ kg/d）小鼠體重均降低（圖1a），附睪部位白色脂肪亦明顯減少（圖1b）；與正常飲食組小鼠比較，HFD小鼠棕色脂肪量顯著下降，不同劑量DNJ組小鼠棕色脂肪重量則顯著增加（圖1c）。由此知DNJ能夠改善由高脂飲食導致的小鼠白色脂肪組織的積累，增加棕色脂肪量，抑制HFD肥胖小鼠體重的增加。

3.2 DNJ抑制HFD肥胖小鼠白色脂肪細胞的增大

白色脂肪以儲能為主，過度積累是肥胖的重要表征，可表現(xiàn)為脂肪細胞體積的增大和數(shù)量的增多。給予小鼠高脂飲食后，附睪部位脂肪累積增多。附睪白色脂肪形態(tài)學HE染色結(jié)果如圖2所示，與Control 組相比，HFD組脂肪細胞形態(tài)增大。給藥不同劑量DNJ（50mg/kg/d、100mg/kg/d）治療后，附睪白色脂肪的大小則明顯縮小。此結(jié)果表明DNJ可改善因高脂飲食而造成的附睪脂肪組織的細胞增大。

3.3 DNJ提高HFD肥胖小鼠棕色脂肪活性

通過對小鼠棕色脂肪特異性基因UCP1、PRDM16的表達量進行檢測，結(jié)果如圖3所示。HFD肥胖小鼠棕色脂肪UCP1、PRDM16表達均低于普通飲食組小鼠，但無統(tǒng)計學意義。而肥胖組小鼠經(jīng)DNJ治療后，UCP1、PRDM16 mRNA表達顯著增加（圖3a、圖3b）。進一步對蛋白表達檢測顯示：棕色脂肪中UCP1、PRDM16 蛋白表達亦顯著增加（圖3c、圖3d）。由此知DNJ可上調(diào)棕色脂肪特異性基因的表達，提高棕色脂肪組織產(chǎn)熱活性，從而發(fā)揮抗肥胖作用。

4. 討論

肥胖是由于白色脂肪分化或代謝異常誘發(fā)的一種代謝性疾病，已是多種心腦血管疾病的誘發(fā)因素之一。當飲食中攝入的脂肪增加時，肥胖的發(fā)生率也隨之增加。因此，尋找安全有效的治療方法具有非常重要的意義。棕色脂肪作為產(chǎn)熱脂肪，可通過高表達UCP1（解偶聯(lián)蛋白），促進線粒體解耦聯(lián)呼吸作用，使機體多余能量以熱能形式釋放。提高棕色脂肪產(chǎn)熱活性可作為一種潛在的治療肥胖的有效手段。

1-脫氧野尻霉（DNJ）作為桑葉中的主要活性成分之一，可顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性而有效降低血糖。 Tsuduki T等研究發(fā)現(xiàn)，DNJ可降低肥胖小鼠內(nèi)臟脂肪量和細胞大小，但其抗肥胖機理目前并未闡明。我們的前期研究結(jié)果顯示：DNJ可通過抑制3T3-L1白色脂肪分化成熟并促進其向棕色脂肪分化而發(fā)揮抗肥胖效應。本課題以HFD誘導的肥胖模型小鼠作為實驗對象，給藥低劑量 DNJ（50mg/kg/d）、高劑量DNJ（50mg/kg/d）4周后，DNJ可有效抑制體重的增加，附睪部位脂肪細胞大小亦明顯小于HFD肥胖組小鼠，這一結(jié)果與文獻報道一致，即DNJ能夠改善因高脂飲食而造成的附睪組織的脂肪細胞增大，抑制HFD肥胖小鼠體重的增加。但50mg/kg/d、100mg/kg/d兩個不同劑量組的作用并無明顯差別。

為進一步探究DNJ抑制肥胖小鼠體重增加的作用是否與調(diào)控棕色脂肪活性有關，本課題對小鼠肩胛部位棕色脂肪特異性基因檢測發(fā)現(xiàn)，與正常飲食小鼠相比，HFD組小鼠UCP1、PRDM16基因的表達有所降低，說明高脂飲食可能損傷棕色脂肪發(fā)育。與HFD組小鼠比較，低劑量DNJ組及高劑量DNJ組小鼠UCP1、PRDM16基因的mRNA及蛋白表達均顯著升高。此結(jié)果說明DNJ可通過增強棕色脂肪組織活性，發(fā)揮抵抗高脂飲食誘導的肥胖作用。

通過以上結(jié)果可知：桑葉提取物DNJ具有抑制HFD小鼠體重增加的抗肥胖作用，這一作用與增強棕色脂肪活性有關，而具體的機制還需進一步的深入研究。

基金項目：

湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（編號17B036）；湖南省教育廳科學研究項目（編號：17A026、18A497）；新型藥物制研發(fā)湖南省重點實驗室（ 2016TP1029〕；2014 年湖南省校企合作人才培養(yǎng)示范基地項目（ 湘教通[2014] 272 號）

作者簡介：

李晴晴（1989-），女，漢族，安徽宿州人，研究生，講師，研究方向：肥胖及代謝性疾病藥理；

王妍（1999-），女，漢族，湖南永州人，藥物制劑專業(yè)在讀本科生；

劉燦（1999-），女，漢族，湖南株州人，藥物制劑專業(yè)在讀本科生；

唐藝榕（1999-），女，湖南懷化人，漢，藥物制劑專業(yè)在讀本科生。