楊露，鄭思韜，鮑元榕，武寶玉，王世杰，徐雅琴

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

多糖（polysaccharide）是指由10個(gè)或10個(gè)以上單糖通過(guò)縮合而形成的鏈狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和海洋生物中，對(duì)生物的代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)等生命活動(dòng)有著至關(guān)重要的作用[1]。研究表明，多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗血栓、降血糖等多種生物活性[2-3]。

藍(lán)靛果，學(xué)名藍(lán)靛果忍冬（Lonicera aerulea L.），又名黑瞎子果，是一種新興的小漿果，在我國(guó)，藍(lán)靛果主要分布在東北、華北和西北地區(qū)。研究表明藍(lán)靛果果實(shí)含有豐富的多酚（花色苷、黃酮）、多糖、維生素、礦物質(zhì)和微量元素等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降血糖等功效[4-7]。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)藍(lán)靛果果實(shí)的研究主要集中在多酚類如黃酮類、花色苷等，對(duì)于藍(lán)靛果多糖的研究鮮有報(bào)道[8-9]。

超聲波輔助法是利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用以及熱效應(yīng)對(duì)原料中的有效成分進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，能夠大大提高提取效率[10]。本文以藍(lán)靛果果實(shí)為原料，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助藍(lán)靛果多糖提取工藝，并進(jìn)一步測(cè)定其清除自由基（DPPH·、O2-·）能力。本試驗(yàn)不僅拓展藍(lán)靛果果實(shí)的研究領(lǐng)域，而且為進(jìn)一步研究藍(lán)靛果果實(shí)多糖提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)靛果果實(shí)：黑龍江省農(nóng)科院牡丹江農(nóng)科所；大孔吸附樹脂D4006：南開大學(xué)化工廠；所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JY92-IIV型超聲破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機(jī)：東京理化機(jī)械株式會(huì)社；WFJ-7200型可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)靛果果實(shí)多糖的制備

稱取一定量藍(lán)靛果果實(shí)勻漿，按照一定的液料比加入去離子水，混勻后，置于一定時(shí)間、一定功率的超聲波條件下進(jìn)行提取。提取液過(guò)濾、濃縮、醇沉（體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液），4℃冰箱靜置過(guò)夜，抽濾，凍干，即得粉紅色的藍(lán)靛果果實(shí)粗多糖。參考課題組前期工作[11]，選取大孔樹脂D4006對(duì)粗多糖進(jìn)行初步純化，得到藍(lán)靛果多糖（blue honeysuckle polysaccharide，BHP）。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[12]。紫外檢測(cè)表明藍(lán)靛果多糖不含多酚和花色苷。

1.2.2 超聲波法輔助提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取藍(lán)靛果果漿10.0 g，放入500 mL燒杯中，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比10∶1、20 ∶1、30 ∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g），超聲波功率（200、300、400、500、600 W），提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，以多糖得率為響應(yīng)值，研究不同提取條件對(duì)提取效果的影響。藍(lán)靛果果實(shí)多糖得率計(jì)算公式：

式中：w為藍(lán)靛果果實(shí)質(zhì)量，g；c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得藍(lán)靛果果實(shí)多糖濃度，mg/mL；v為溶液體積，mL。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化超聲法輔助提取工藝研究

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以提取時(shí)間（X1）、液料比（X2）和超聲功率（X3）為考察的變量，多糖的得率為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)靛果多糖的工藝，采用Design-Expert軟件分析數(shù)據(jù)，建立三元二次模型進(jìn)行擬合分析，模型擬合公式如下：

式中：Y是因變量；β0為常系數(shù)；βi為線性系數(shù)（主效應(yīng)）；βii為二次系數(shù)；βij是兩因素交互作用系數(shù)。

1.2.4 藍(lán)靛果果實(shí)多糖清除自由基活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]，測(cè)定不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）藍(lán)靛果多糖對(duì)DPPH·和O2-·清除活性，VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3次試驗(yàn)結(jié)果的平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean±SD）表示，采用DPS 6.5分析軟件對(duì)單因素試驗(yàn)的各因素進(jìn)行比較分析，采用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素對(duì)多糖得率的影響見圖1。

圖1 單因素對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of singal-factor on polysaccharides yield

由圖1a可知，在10 min～40 min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，多糖得率先增加，隨后逐漸降低，40 min時(shí)達(dá)到最大值。多糖得率降低的原因可能是隨著時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，超聲波的空化作用使多糖發(fā)生降解使得率降低[14-15]。因此選取40 min作為提取的最佳時(shí)間，得率為（8.05±0.08）%。圖1b結(jié)果顯示，多糖得率隨著液料比的增大呈上升趨勢(shì)，當(dāng)液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率最高為（8.26±0.09）%，隨后，開始降低。這可能是由于液料比增大，超聲波的空化作用會(huì)減弱，不利于多糖的提?。划?dāng)溶劑適宜時(shí)，多糖溶出最多，得率最高[16]。因此選取40∶1（mL/g）作為提取的最佳液料比。超聲功率對(duì)多糖得率的影響見圖1c，隨著超聲功率的升高，得率先增加再減小，可能是超聲功率的增大，多糖會(huì)產(chǎn)生降解[17-18]。在300 W的條件下得率最高為（8.30±0.08）%，因此選取400 W作為提取的最佳超聲功率。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

2.2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及藍(lán)靛果果實(shí)多糖得率Table 1 Box-Behnken design and yield of the polysaccharides from blue honeysuckle fruits

用軟件Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗(yàn)，得到的回歸方程如下所示：

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析如表2所示。

表2 多糖得率方差分析Table 2 Variance analysis of the polysaccharides yield

由表2可知，回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異極顯著（P<0.000 1），失擬項(xiàng)和變異系數(shù)的數(shù)值表明該試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)學(xué)模型具有較好擬合度，可用該模型對(duì)超聲波輔助提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖進(jìn)行預(yù)測(cè)。另外，由方差分析可知，各個(gè)因素間交互作用對(duì)多糖得率影響的顯著程度為X1X2>X2X3>X1X3。影響藍(lán)靛果多糖提取率大小因素依次為：提取時(shí)間>超聲功率>液料比。

2.2.2 模型準(zhǔn)確性分析

模型準(zhǔn)確性分析見圖2。

由圖2a可知，數(shù)據(jù)點(diǎn)基本集中在一條直線上，殘差符合正態(tài)分布規(guī)律；由圖2b可知，各個(gè)殘差的分布分散且無(wú)規(guī)則，都在合理的極限范圍內(nèi)，說(shuō)明殘差數(shù)據(jù)正常。真實(shí)值和擬合值的關(guān)系如圖2c所示，二者的數(shù)據(jù)點(diǎn)均集中在一條直線附近，試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合值比較接近。綜上可知，本試驗(yàn)建立的模型合理，適合優(yōu)化超聲提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖。

2.2.3 邊際效應(yīng)分析

單因子邊際效應(yīng)曲線見圖3。

圖2 模型準(zhǔn)確性分析Fig.2 Accuracy analysis of model

圖3 單因子邊際效應(yīng)曲線Fig.3 Marginal effect curve of single factor

如圖3所示，當(dāng)提取時(shí)間、液料比和超聲功率低于各自的臨界編碼值（0.10、0.05、0.12）時(shí)，多糖得率增加速率大于零，但呈下降的趨勢(shì)，說(shuō)明多糖得率隨著各因素的增大而逐漸達(dá)到最大值；當(dāng)三者分別取臨界編碼值時(shí)，多糖得率增長(zhǎng)率均為零，即多糖得率達(dá)到最大；當(dāng)高于臨界編碼值時(shí)，多糖得率增長(zhǎng)率小于零，說(shuō)明多糖得率開始下降并且下降的速率逐漸增大。由圖3可知，各因素的變化程度的大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>超聲功率>液料比，與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.4 交互效應(yīng)分析

為了得到某兩個(gè)因素同時(shí)對(duì)多糖得率Y值的影響，觀察在其它因素條件固定不變情況下，某兩個(gè)因素對(duì)多糖得率Y值的影響。用Design-Expert 8.0.6軟件作出相應(yīng)的響應(yīng)面圖，對(duì)這些因素中交互項(xiàng)之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析，如圖4所示。

圖4 各因素間的交互作用Fig.4 Interaction among factors

由圖4a可知，時(shí)間與液料比對(duì)多糖得率的交互影響呈拋物線形，說(shuō)明時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)多糖得率影響顯著。由圖變化趨勢(shì)可知，當(dāng)時(shí)間在35 min～45 min 之間某固定值，液料比在 32 ∶1（mL/g）～47∶1（mL/g）之間某固定值時(shí)，曲面有最高點(diǎn)，即在此區(qū)間某一固定條件，多糖得率有最值；圖4b拋物線曲面顯示超聲功率和提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響明顯。當(dāng)提取時(shí)間在35 min～47 min，功率在220 W～400 W范圍內(nèi)，多糖的得率比較高。由圖4c可知，在液料比取 35 ∶1（mL/g）～45 ∶1（mL/g）、超聲功率取270 W～380 W的范圍內(nèi)，多糖得率相對(duì)較大，且在此范圍內(nèi)，多糖得率可取最大值。當(dāng)液料比一定時(shí)，隨著超聲功率的增大，多糖得率增大，超聲功率繼續(xù)增大，得率有下降的趨勢(shì)；當(dāng)超聲功率一定時(shí)，隨著液料比的增大，多糖得率先增大后減小。

經(jīng)以上回歸模型分析，藍(lán)靛果果實(shí)多糖的最佳提取工藝為：提取時(shí)間 41.10 min，液料比 40.70∶1（mL/g），超聲功率309.15W。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將各因素調(diào)整為提取時(shí)間 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超聲功率 310 W進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。在此條件下，多糖得率實(shí)際測(cè)量值（8.31±0.23）%與預(yù)測(cè)值8.36%接近，表明用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖的工藝條件是可行的。

2.3 藍(lán)靛果實(shí)多糖清除自由基活性

研究表明許多疾病的發(fā)生和發(fā)展同自由基密切相關(guān)，據(jù)報(bào)道，由過(guò)量自由基引起的疾病，已超過(guò)100余種，如高血壓、糖尿病、癌癥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化以及老年癡呆等[19-21]。因此尋找高效、廉價(jià)、低毒天然抗氧劑，清除體內(nèi)自由基，對(duì)治療疾病和保護(hù)人體健康很有益處。

多糖BHP對(duì)DPPH·和O2-·兩種自由基的清除效果見圖5。

圖5 藍(lán)靛果多糖清除自由基能力Fig.5 Scavenging activities of the polysaccharide on the radicals

由圖5可知，當(dāng)濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL時(shí)，多糖BHP對(duì)DPPH·的抑制能力隨著濃度的增高而增大（P<0.05），在1.0 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到最大（53.78±0.89）%，IC50為 5.40 mg/mL。當(dāng)濃度在 0.1 mg/mL～0.4 mg/mL時(shí)，多糖BHP對(duì)O2-·的清除能力隨著濃度的增高而增大（P<0.05）；在 0.4 mg/mL～1.0 mg/mL 時(shí)，BHP的清除能力隨著濃度的增高變化較小，在1.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大（67.79±1.01）%，IC50為 0.28mg/mL?？芍?，藍(lán)靛果多糖對(duì)2種自由基均有一定的清除作用，但清除能力均小于對(duì)照VC。

3 結(jié)論

響應(yīng)面分析得到回歸模型合理，試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合值接近，適合優(yōu)化超聲輔助提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖。超聲波輔助提取藍(lán)靛果果實(shí)多糖最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間 41 min，液料比 41 ∶1（mL/g），超聲功率310 W，得率為（8.31±0.23）%。影響藍(lán)靛果多糖提取率大小因素依次為：提取時(shí)間>超聲功率>液料比。藍(lán)靛果多糖BHP對(duì)DPPH·和O2-·均具一定的清除活性，IC50分別為 5.40、0.28 mg/mL。