吳國美，張秀玲，高詩涵，劉明華

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030）

藍靛果是一種可食用的野生漿果，果實柔軟多汁、風味獨特，且有豐富的營養(yǎng)物質[1]。藍靛果含有花色苷、黃酮類化合物、多酚和大量的維生素等[2]。研究表明，藍靛果果實中的有機酸、碳水化合物含量分別以檸檬酸、葡萄糖最多，并含有16種氨基酸等[3]。藍靛果具有較強的抗氧化作用，還有降血脂、抗肥胖、抗脂肪肝、抗輻射和抗癌等作用[4-5]。在抵抗疾病和保持身體健康等方面有重要的作用，有較好的發(fā)展前景[6]。

藍靛果的采收集中，貯藏期短，果實采收后容易出現(xiàn)組織軟化、腐敗變質等問題，所以鮮食只占市場的一小部分，更多的是被用于制作各種加工品[7-8]。各種小漿果的飲品就是以漿果汁為主要原料生產(chǎn)的[9]。因此，對藍靛果果汁提取工藝進行優(yōu)化，對于提高藍靛果的利用率和價值至關重要。酶處理有助于促進細胞壁中纖維素水解和果膠解聚，提高出汁率[10-12]。

目前，關于藍靛果的研究報道有很多，大多都是關于栽培，針對藍靛果的高值化加工方面研究還不多。本試驗以藍靛果作為研究對象，利用所選擇的果膠酶和纖維素酶對藍靛果的出汁率進行響應面優(yōu)化，研究這些酶對藍靛果果汁中的生物活性物質（總酚、花色苷、總黃酮等）含量的影響，并對藍靛果果汁的抗氧化特性進行研究，為企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果：采自小興安嶺伊春地區(qū)的鮮果，挑選無損傷鮮果并在-20℃下儲存?zhèn)溆?；果膠酶（107000U/g）、纖維素酶（101 900 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；1，10-菲啰啉（1，10-phenanthroline monohydrate，BP）：天津市科密歐化學試劑有限公司；福林-酚試劑、1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[（2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiaoline-6-sulphonic acid），ABTS]：美國 Sigma 公司；其他常見試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-1）：常州賽普實驗儀器廠；多功能打漿機（MJ-WJS1222F）：美的集團股份有限公司；電子天平（FA1004）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（HR/T20M）：湖南赫西儀器裝備有限公司；紫外可見分光光度計（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍靛果的酶解工藝

取適量的藍靛果于室溫（20℃）下解凍，用打漿機破碎成勻漿，準確稱取20 g的藍靛果漿加入錐形瓶中，再加入一定量的果膠酶和纖維素酶，攪拌均勻，然后將其放入一定溫度的水浴鍋中酶解一定時間，酶解后5 000 r/min離心15 min，得到藍靛果的清汁。

1.3.2 酶解優(yōu)化試驗

1.3.2.1 單因素試驗

準確稱取20 g藍靛果漿，初步選定果膠酶添加量為0.2%，纖維素酶添加量為0.6%，酶解時間為1.5 h，酶解溫度50℃為基礎條件，以出汁率為指標，依次研究果膠酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、纖維素酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解時間（1、1.5、2、2.5、3 h）、酶解溫度（30、40、50、60、70℃）的條件下，各因素對藍靛果出汁率的影響，每個試驗重復3次。

1.3.2.2 響應面優(yōu)化試驗設計

根據(jù)以上單因素試驗結果，以藍靛果的出汁率為響應值，進行響應面分析，得到最優(yōu)的工藝條件。酶解響應面試驗因素及水平見表1。

表1 酶解響應面試驗因素及水平Table1 Enzymatic response surface test factors and levels

1.3.2.3 出汁率的測定

取經(jīng)酶解后的藍靛果漿20 g于50 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，取上清液，測定上清液的質量，依據(jù)公式計算出汁率[13]。

1.3.3 活性物質及抗氧化活性的測定

1.3.3.1 生物活性物質含量的測定

VC含量的測定采用分光光度計法[14]；花色苷含量的測定參照王純等[15]的pH示差法測定；總酚含量的測定參照王琴等[16]方法測定；總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al（NO3）3比色法[17]。

1.3.3.2 體外抗氧化活性的測定

DPPH自由基清除能力的測定參照H.Liang等[18]方法測定；羥自由基（·OH）清除能力的測定參照張麗媛等[19]方法測定；ABTS+·清除能力的測定根據(jù)ZHANG Nai-xun 等[20]和 Helena 等[21]方法測定。

2 結果與分析

2.1 酶解優(yōu)化單因素試驗結果

2.1.1 果膠酶添加量對出汁率的影響

果膠酶常應用于果蔬，可以有效地提高果蔬的出汁率，保證產(chǎn)品貯存穩(wěn)定性和改善其過濾速度等[22]。果膠酶添加量對藍靛果出汁率的影響結果見圖1。

圖1 果膠酶添加量對藍靛果出汁率的影響Fig.1 Effect of pectinase addition on lonicera edulis juice yield

由圖1所示，以不添加果膠酶的樣品為對照，藍靛果的出汁率隨著果膠酶的增加先快速增大后變得平緩。因為底物濃度一定時，果膠酶添加量越大，底物和酶的反應會越完全，藍靛果的出汁率會越高。當果膠酶添加量增加到一定量，反應就會飽和，出汁率就增加不明顯。當果膠酶添加量超過0.3%后，藍靛果的出汁率增加趨勢較為緩慢，維持在76%左右。使用大量的果膠酶會造成浪費和影響藍靛果汁的口味等。因此，選擇果膠酶的添加量在0.2%～0.3%。

2.1.2 纖維素酶添加量對出汁率的影響

纖維素酶可降解漿果中的纖維素、半纖維素、果膠等，從而提高出汁率[23]。纖維素酶添加量對藍靛果出汁率的影響見圖2。

由圖2可知，在纖維素酶酶解過程中，以不添加纖維素酶的樣品為對照，增加纖維素酶的添加量，出汁率會不斷增大。藍靛果在纖維素酶添加量達到1.0%時，出汁率達到了77.18%，與對照相比出汁率提高了8.87%。繼續(xù)增加纖維素酶的用量，藍靛果的出汁率增加不明顯。因為過量的纖維素酶不能與足夠的底物相互反應，所以出汁率就會增加不明顯。因此，選擇纖維素酶的添加量為0.8%～1.0%。

2.1.3 酶解時間對出汁率的影響

圖2 纖維素酶添加量對藍靛果出汁率的影響Fig.2 Effect of cellulase addition on lonicera edulis juice yield

酶會對植物的細胞壁進行水解，促進細胞內的物質釋放出來，從而增加出汁率。酶解時間對藍靛果出汁率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對藍靛果出汁率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on juice yield of lonicera edulis

由圖3可以看出，以0.5 h為對照，酶解時間越長，出汁率越高。藍靛果的出汁率在0.5 h～1.5 h內漲幅較快，當酶解時間為1.5 h時，出汁率達到了72.83%。酶解時間超過1.5 h后，出汁率的增加變得緩慢。因為在一定的反應時間內，酶和底物就會反應完全，再增加反應的時間，對藍靛果的出汁率影響不大。綜合考慮，選擇酶解時間為1.5 h。

2.1.4 酶解溫度對出汁率的影響

酶解溫度對藍靛果出汁率的影響見圖4。

由圖4可知，以常溫20℃為對照，酶解溫度在20℃～50℃范圍內時，藍靛果的出汁率隨酶解溫度的升高而增大。當溫度達到50℃時，藍靛果的出汁率達到最大值73.83%。隨后再增加溫度，藍靛果的出汁率降低。這是因為，酶要在一定溫度范圍內才能發(fā)揮其活性的作用，酶解溫度過低，底物與酶不能有效的反應，過高的溫度則會使酶失活[24]。在酶解過程中，選擇40℃～50℃作為酶解的最適溫度。

圖4 酶解溫度對藍靛果出汁率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on juice yield of lonicera edulis

2.2 酶解優(yōu)化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

綜合單因素試驗結果可知，酶解時間超過1.5 h后藍靛果出汁率增長較小，為節(jié)約成本和時間，選定果膠酶添加量（A）、纖維素酶添加量（B）和酶解溫度（C）3個因素進行Box－Behnken設計響應面分析試驗，得到最佳的酶解優(yōu)化條件。響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken design and results

2.2.2 方差分析及互交作用

用Design－Expert 8.0對數(shù)據(jù)進行擬合分析，得到回歸方程為：藍靛果的出汁率/%＝84.75+0.79A+0.39B+0.40C+1.89AB+0.32AC+0.087BC-1.89A2-2.66B2-0.94C2?；貧w模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

從表3中可以看出，回歸模型的顯著性很高（P＝0.000 4＜0.01），缺乏擬合用于驗證模型的充分性且不顯著（P＝0.462 5>0.05），表明該模型的試驗數(shù)據(jù)可靠，R2＝0.961 5接近1，表明此模型擬合較好，試驗誤差小，可用此模型對酶解的藍靛果出汁率進行分析和預測。根據(jù)F值可知，各個因素對藍靛果出汁率的影響大小順序為：果膠酶（A）>酶解溫度（C）>纖維素酶（B）。

響應曲面圖和等高線圖是回歸方程的圖形化表示，說明獨立變量對響應變量的主要交互作用[25]。各因素交互作用對藍靛果出汁率影響的等高線圖和響應面圖見圖5。

圖5顯示了藍靛果出汁率與各因素之間的關系，由圖5a可以看出，隨著酶用量的增加，藍靛果出汁率先增加后減少，且果膠酶對藍靛果出汁率的影響要大于纖維素酶；由圖5b可以看出，果膠酶對藍靛果出汁率的影響要遠大于酶解溫度；由圖5c可以看出，酶解溫度和纖維素酶用量對藍靛果出汁率的影響不明顯，且酶解溫度對藍靛果出汁率的影響要大于纖維素酶。這與表3中方差分析的結果一致。

圖5 各因素交互作用對藍靛果出汁率影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contour map and response surface diagram of the interaction of various factors on juice yield of lonicera edulis

2.2.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

根據(jù)響應面的回歸模型，確定藍靛果出汁率的最佳條件為：果膠酶添加量0.27%、纖維素酶添加量0.92%、酶解溫度46.40℃，此時預測的藍靛果的出汁率為86.98%。為便于實際操作，選擇果膠酶添加量為0.27%、纖維素酶添加量為0.92%、酶解溫度為47℃。在這個工藝條件下，得到藍靛果的出汁率為85.67%，與預測值的差異為1.31%，表明此回歸模型可以較好地預測藍靛果的出汁率。

2.3 酶解對藍靛果汁品質的影響

采用優(yōu)化后的最佳酶解工藝對藍靛果進行酶解，測定酶解后藍靛果汁中各活性物質的含量，對照組為自然解凍下未加酶的藍靛果汁。酶解前后藍靛果汁中活性物質含量的變化結果見圖6。

由圖6可知，復合酶解后，藍靛果汁中的活性物質含量都有一定的增加。復合酶解后，藍靛果汁中的活性物質含量與對照組相比有顯著增加，VC含量可達5.11 mg/mL、花色苷含量為3.13 mg/mL、總酚含量為3.11 mg/mL、總黃酮含量達到6.97 mg/mL。通過對比單一酶解和復合酶解后藍靛果汁中活性物質含量，可以得出，復合酶解工藝有利于藍靛果汁中活性物質的溶出。

圖6 酶解前后藍靛果汁中活性物質含量的變化Fig.6 Changes of active substances in lonicera edulis juice before and after enzymolysis

2.4 藍靛果汁體外抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力

藍靛果汁對DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 藍靛果汁對DPPH自由基的清除能力Fig.7 Scavenging activity of lonicera edulis juice on DPPH free radical

由圖7可知，酶解前后的藍靛果汁和VC對照組對DPPH自由基能較好地清除，在所選的質量濃度范圍內，清除率隨質量濃度增加而增強。酶解前后的藍靛果汁對自由基的清除活性有一定差異，VC的清除能力要優(yōu)于藍靛果汁，藍靛果汁的清除能力酶解后要優(yōu)于酶解前，酶解前后的IC50值分別為0.551 mg/mL和0.285 mg/mL。當質量濃度為1.8 mg/mL時，酶解前后的藍靛果汁對DPPH自由基的清除率可達80.56%和88.13%。

2.4.2 ·OH清除能力

·OH是最活潑的活性氧自由基，是有毒的氧化代謝副產(chǎn)物，可以改變細胞的功能和結構等[26]。藍靛果汁對·OH的清除能力見圖8。

圖8 藍靛果汁對·OH的清除能力Fig.8 Scavenging activity of lonicera edulis juice on·OH

由圖8可知，以VC為對照，酶解前后的藍靛果汁對·OH的清除率隨質量濃度增加而增大，且清除率均低于VC。酶解前后的IC50值分別為8.66 mg/mL和6.37 mg/mL。當質量濃度為12 mg/mL時，酶解前后的藍靛果汁對·OH的清除率可達61.40%和74.12%。藍靛果汁對·OH有較好的清除作用。

2.4.3 ABTS+·清除能力

藍靛果汁對ABTS+自由基的清除能力見圖9。

圖9 藍靛果汁對ABTS+自由基的清除能力Fig.9 Scavenging activity of lonicera edulis juice on ABTS+free radical

由圖9可以看出，VC和酶解前后的藍靛果汁對ABTS+·的清除能力隨質量濃度增加而增大，藍靛果汁有較強的清除能力，且低于VC。酶解前的藍靛果汁在質量濃度為60 mg/mL時，對ABTS+·的清除率可達92.90%。酶解后的藍靛果汁對ABTS+·的清除能力要優(yōu)于酶解前，酶解后的藍靛果汁在質量濃度為40mg/mL時，ABTS+·的清除能力基本達到平衡，清除率高達94%左右。酶解前后的IC50值分別為17.15 mg/mL和11.62 mg/mL。

3 結論

利用響應面設計試驗對藍靛果的酶解條件進行優(yōu)化。得到的最佳條件為：果膠酶添加量0.27%、纖維素酶添加量0.92%、酶解溫度為47℃。在此工藝條件下，藍靛果的出汁率為85.67%。酶解對藍靛果汁中的VC、花色苷、總酚和總黃酮都有積極的影響，其中對VC含量和總黃酮含量的影響較為顯著。通過對DPPH·、·OH、ABTS+·的清除能力來評價藍靛果汁的抗氧化活性，酶解對藍靛果汁的抗氧化能力有顯著提升，IC50值減小。酶解后的藍靛果汁具有較高的清除率，當質量濃度為1.8 mg/mL時，藍靛果汁對DPPH自由基的清除率為88.13%；當質量濃度為12 mg/mL時，藍靛果汁對·OH的清除率為74.12%；藍靛果汁在質量濃度為60mg/mL時，ABTS+·的清除率達到最大為94.67%。利用酶解法提高藍靛果的出汁率，增加其生物活性物質的溶出，提高其抗氧化活性，這有利于藍靛果高值化研究和功能性產(chǎn)品的開發(fā)。