劉 偉 孫江浩 張菊華 張 群 朱向榮 蘇東林 單 楊*

（1 湖南省農業(yè)科學院 湖南省農產品加工研究所 長沙410125 2 中南大學隆平分院 長沙410125 3 美國農業(yè)部貝爾茨維爾人類營養(yǎng)研究中心 美國貝爾茨維爾20705）

黃花菜（Hemerocallis fulva）又名金針菜，為百合科多年生草本植物，其食用部分為花蕾，是我國的特色蔬菜之一[1-2]。黃花菜被列為“四大素山珍”之一，色澤金黃，香味濃郁，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，富含糖類、蛋白質、維生素、無機鹽及多種人體必需的氨基酸，其中胡蘿卜素和維生素C 含量是西紅柿的5 倍，具有平肝養(yǎng)血、消腫利尿、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)痛、通乳、健胃和安神的功能[3-6]。現(xiàn)代藥理學研究顯示，黃花菜具抑郁癥、抗炎和抗失眠等多種藥理作用[4-6]，可以促進睡眠小鼠的神經變化[5]并影響大鼠的運動活力[7]。此外，黃花菜提取物具有抗氧化[4]和抑制脂質過氧化的能力[8]。前期植物化學成分研究表明，黃花菜中含有多酚、類胡蘿卜素、黃酮類等多種成分[3，8-10]。

超高效液相色譜-線性離子阱和靜電場軌道離子阱質譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap）技術是近年來質譜技術發(fā)展的杰出代表，結合了超高效液相的高效、快速分離性能和高分辨率質譜的高準確、靈敏性，可同時實現(xiàn)母、子離子的高分辨采集及多級質譜碎裂信息獲取，且可提供化合物的精確分子質量信息，不僅可以鑒定已知化合物，還可以通過不同化合物的裂解規(guī)律及特征碎片離子來推斷未知化合物[11-12]。該技術可為小分子化學成分的鑒定及分析提供更多、更準確的信息。目前，對黃花菜的研究主要集中在采用HPLC-DAD 測定干制過程中特定抗氧化成分含量、提取分離和藥理活性等方面[6，13-14]，而黃花菜化學成分的系統(tǒng)鑒定分析則研究較少。

本研究采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨質譜法分析黃花菜中的化學成分，根據液相保留時間、紫外吸收、精確分子質量數據、多級質譜碎片離子和相關文獻報道等手段進行結構鑒定，為探討黃花菜的藥效物質基礎和類似化合物的結構鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

UHPLC-HRAMn 質譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技有限公司。包括LTQ Orbitrap XL 線性離子阱軌道阱組合式質譜儀、Accela 1250 輸液泵、PAL HTC 自動進樣器、PDA 檢測器（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）、和安捷倫G1316A 柱溫箱（Agilent，Palo Alto，CA）。

AL 204 型十萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ 5200E 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機，長沙邁佳森儀器設備有限公司；微量移液器，德國Eppendorf 公司；A11 高速不銹鋼粉碎機，德國IKA 公司；FD-2 真空冷凍干燥機，中國博醫(yī)康公司。

1.2 主要材料與試劑

新鮮黃花菜（品種：白花）：于7月采自湖南省衡陽市祁東縣。根據色澤和外形，選擇均一成熟度進行采收，一般為抽穗后大約27～35 d。所有樣品在采摘后30 min 內送到實驗室，并在4 ℃儲存待干燥處理。

乙腈、甲醇（色譜純），美國Fisher Scientific公司；甲酸（色譜純），美國Sigma Aldrich 公司；其它試劑均為分析純級。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil Gold AQ RP-C18 UHPLC色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.9 μm），Thermo Fisher Scientific；UltraShield 保 護柱。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫：0～10 min，4% B→15% B；10～20 min，15% B→70% B；20～25 min，70% B；流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃。初始比例洗脫平衡時間5 min，紫外采集范圍200～400 nm。

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子源，負離子檢測模式；鞘氣為70 單位，輔助氣為15 單位，噴霧電壓為4.8 kV，毛細管溫度為270 ℃，毛細管電壓為15.0 V，套管透鏡補償電壓為70 V。數據采集范圍m/z100～1 500，分辨率30 000。自動增益控制（AGC）為2×105，F(xiàn)T-MS/MS 二級掃描AGC 為1×105，隔離寬度為1.5 amu，最大離子注入時間為500 MS。二級質譜采用動態(tài)數據依賴性掃描，碰撞能量設為35%，多級質譜選取上一級最高峰離子掃描碰撞誘導解離碎片。

1.4 樣品制備

黃花菜采后即在真空冷凍干燥機中凍干，在0.006 mbar、-50 ℃下處理24 h 至水分含量大約10%。干燥樣品粉碎后過80 目篩，在塑料樣品瓶中室溫貯存待分析。

取黃花菜粉末樣品0.3 g 加入10.0 mL 甲醇-水溶液（體積比70∶30）后，室溫下超聲提取1 h，提取液于2795 g 離心10 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜（PTFE），置于2 mL HPLC 進樣瓶中待UHPLC-HRAMn 分析，進樣量2 μL。

2 結果與討論

2.1 UHPLC-UV-HRMSn 分析條件優(yōu)化

為獲得良好的色譜峰形和質譜信號響應，試驗優(yōu)化了流動相組成、洗脫梯度、流速、柱溫等參數使其達到了理想的分辨率和成分的有效分離。比較了甲醇-水、乙腈-水等幾種類型的溶劑體系及洗脫模式。結果發(fā)現(xiàn)，采用0.1%甲酸的乙腈-水流動相系統(tǒng)獲得了理想的分離性能，甲酸的使用有效提高了分辨率，同時消除了拖尾；0.3 mL/min的流速和40 ℃柱溫可以有效提高分離效率。酚類化合物鑒定的紫外波長為350 nm。色譜圖如圖1所示。

2.2 咖啡?？鼘幩岷忘S酮類化合物的鑒定

通過精確的質量分析、多級質譜碎片離子信息、相對豐度及相關文獻報道，對黃花菜化學成分進行分析鑒定，共鑒定了27 個組分，其中包括酚酸類12 個、黃酮醇類15 個及其它類1 個，各化學成分的保留時間、高分辨質譜實測值、多級質譜碎片種類、相對豐度、紫外吸收及誤差等列于表1。

化合物1 準分子離子峰m/z 191[M-H]-最可能的分子式為C7H11O6，誤差均小于2。其產生二級碎片離子m/z 173 和127，說明結構中存在1 個H2O 分子和1 個CH4O3基團，此特征碎片離子裂解規(guī)律與奎寧酸一致。

化合物2，3，8 的分子離子峰[M-H]-均為m/z 353，結合精確相對分子質量可推測它們的分子式為C16H17O9（單咖啡酰基奎寧酸，CQA），誤差均小于2。主要的二級質譜碎片為m/z 191 和179，分別為失去奎寧酸部分和咖啡酸部分的碎片離子，以及進一步失去H2O 的碎片離子m/z 173 和161等。通過對比分析多級質譜碎片離子種類和相對離子強度，可進一步確定咖啡?；诳鼘幩崮负松系孽；恢??；衔?，3 的母離子均中性丟失一分子咖啡酰（162 u）而產生m/z 191，可知咖啡酰取代基的位置分別為3-或5-。通過分析化合物2 和3 的其它碎片離子，可以將它們鑒定為3-CQA 和5-CQA?；衔? 的母離子在裂解過程中丟失一分子咖啡酰（162 u）產生m/z 191，且進一步丟失一分子水（18 u）產生m/z 173，結合文獻[9，15-16]數據，在反相色譜中4-CQA 的保留時間更長，由此推測其為4-CQA。

化合物4，5，10 的分子離子峰[M-H]-均為m/z 337，精確相對分子質量可推測它們最可能的分子式為C16H17O8。主要的二級質譜碎片為m/z 191，163，119，均產生碎片m/z 163，此為典型的香豆酸碎片峰，結合保留時間及相關文獻[15]，推測化合物為3 -pCoQA，5 -pCoQA，4 -pCoQA（p -Coumaroylquinic acid，對香豆?？鼘幩幔?。

化合物6，7，13 的分子離子峰[M-H]-均為367，精確相對分子質量可推測它們最可能的分子式為C17H19O9。三者在負離子模式下均產生碎片離子峰m/z 191，其紫外吸收最大波長同為323，219。其中，化合物6 和7 的母離子在MS2中均中性丟失一分子阿魏酰（176 u）產生m/z 191，由此推測兩者的阿魏酰取代基位置為3 或5 位，同時結合保留時間，推斷其為3-FQA 和5-FQA（Feruloylquinic acid，阿魏?？崴幔??；衔?3 的準分子離子峰在裂解過程中先失去一分子阿魏酰（176 u），繼續(xù)失去一分子水（18 u）產生m/z 173，由此推測其分子結構中阿魏酰取代基的位置為4位，推斷其為4-FQA。

化合物12，14 的分子離子峰[M-H]-均為335，精確相對分子質量可推測它們最可能的分子式為C16H15O8。在二級質譜裂解過程中m/z 335 準分子離子峰丟失一分子莽草酸殘基產生m/z 179 ，繼續(xù)失去-COO 產生m/z 135，為咖啡酸的特征峰，紫外最大吸收波長為220，323 nm，與相關報道[17-18，27]相似，可推測其為咖啡酰莽草酸。然而，由于缺乏相應的對照品，咖啡酰在莽草酸母核上的具體取代基位置尚難以確定，由此僅將化合物12，14 鑒定為咖啡酰莽草酸。

圖1 黃花菜液相色譜圖（350 nm）Fig.1 HPLC-UV chromatogram at 350 nm of daylily flower

化合物19 準分子離子峰[M-H]-為m/z 609，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C27H29O16。在其ESI-MS2譜中，m/z 301 為母離子[M-H]-脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-。而m/z 301 在ESI-MS3譜中則產生m/z 179 和m/z 151，其中m/z 179 發(fā)生RDA 反應形成碎片離子m/z 151，這與槲皮素典型的裂解途徑相似，推斷該化合物為槲皮素-3-O-蕓香糖苷即蘆丁，與文獻報道[9，19-20]黃花菜中蘆丁裂解特征一致。

化合物20 準分子離子峰[M-H]-為m/z 463，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C21H19O12。在二級質譜裂解過程中m/z 463 準分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產生m/z 301[MH-Glc]-，m/z 301 苷元C 環(huán)開環(huán)裂解產生m/z 179

和m/z 151。由此可確定化合物20 為異槲皮素。

表1 UHPLC-LTQ-Orbitrap 質譜鑒定黃花菜樣品中酚類物質Table 1 The identification of phenolic compounds in daylily sample by UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS

（續(xù)表1）

化合物9 準分子離子峰[M-H]-為m/z 625，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C27H29O17。在二級質譜裂解過程中m/z 625 準分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產生m/z 463[MH-Glc]-和一分子葡萄糖殘基產生槲皮素m/z 301[M-H-2Glc]-，在ESI-MS3 譜中產生m/z 300[MH-2Glc-H]-和m/z 299[M-H-2Glc-2H]-，其紫外吸收最大波長為348，294 nm，結合文獻報道[21]，此波長為槲皮素衍生物，位于3，7-O 取代基，由此推測此化合物為槲皮素-3，7-二-O-葡萄糖苷。

化合物11 準分子離子峰[M-H]-為m/z 771，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C33H39O21。在二級質譜裂解過程中m/z 771 準分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產生m/z 609[MH-Glc]-，在隨后的多級質譜裂解過程中，其進一步產生m/z 301[M-H-Glc-Rha]-，m/z 179，m/z 151，其與蘆丁的裂解規(guī)律一致。結合其精準分子質量和文獻[9]，推斷該化合物為槲皮素-3’-O-蕓香糖苷-7’-O-葡萄糖苷。

化合物21 準分子離子峰[M-H]-為m/z 579，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C26H27O15。在其ESI-MS2 譜中，m/z 301 為母離子脫掉鼠李糖和吡喃阿拉伯糖（278 u）形成的特征碎片[M-H-Rha-Ara]-。而m/z 271 為槲皮素失去一分子CO 后脫去2 個H 形成的，推斷該化合物為槲皮素-3-鼠李糖-（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物23 準分子離子峰[M-H]-為m/z 433，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C20H17O11。在二級質譜中出現(xiàn)了m/z 301 的碎片離子，為脫去一份子中性吡喃阿拉伯糖的槲皮素苷元[M-H-Ara]-。結合在黃花菜中已報道的化學成分[9]，推斷為槲皮素-3-O-吡喃阿拉伯糖苷。

化合物15，18，25，26 均為異鼠李素糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，負離子掃描的分子離子峰m/z 分別為477，769，623 和477。在二級質譜裂解過程中均產生碎片m/z 315 和m/z 314，在隨后的多級質譜裂解過程中，進一步中性丟失1 分子CH3后產生m/z 300，然后繼續(xù)丟失1 分子HCO和CO 分別產生m/z 271 和m/z 243，其為典型的異鼠李素糖苷碎片峰，化合物15，18，25 與26 具有相同的母核，只是糖取代種類不同?；衔?5與26 分子離子峰[M-H]-均為477，其二級離子碎片離子m/z 315 為母離子[M-H]-丟失1 分子單糖苷（162 u），m/z 314 為[M-H-162-H]-，根據相對分子質量與文獻相關信息[9，22-23]，推測其為異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-已糖苷。對化合物18 進行二級質譜分析，產生碎片離子m/z 605[M-H-162-2H]-，m/z 623[M-H-146]-，m/z 315[M-H-146-308]-，m/z 314[M-H-146-308-H]-，表明其可能是鼠李糖苷（146 u）和蕓香糖苷（308 u），推斷該化合物為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷-7-O-鼠李糖苷。對化合物25 進行二級質譜分析，m/z 315 為母離子[M-H]-脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根據相對分子質量、紫外吸收特征及相關文獻[24]，因而推測其為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷。

化合物17，22，24，28 均為山奈酚糖苷衍生物，具有相似的紫外吸收，負離子掃描的分子離子峰m/z 分別為739，593，593 和417。化合物22，24，28 進行二級質譜分析均產生碎片m/z 285，其為典型的山奈酚糖苷碎片峰。在隨后的多級質譜裂解過程中，進一步中性丟失1 分子CO 產生m/z 257，其與山奈酚的裂解規(guī)律一致?；衔?2，24準分子離子峰[M-H]-m/z 593，m/z 285 為母離子[M-H]-依次脫掉鼠李糖和葡萄糖（308 u）形成的特征碎片[M-H-Glc-Rha]-，根據相對分子質量、紫外吸收特征及相關文獻[9，21，25]，用而推測其為山奈酚-3-O-蕓香糖苷。對化合物28 進行二級質譜分析，m/z 285 為母離子[M-H]-脫掉阿拉伯糖（132 u）形成的特征碎片[M-H-Ara]-，根據相對分子質量與文獻相關信息[21，24]，推測其為山奈酚-3-O-阿拉伯糖苷。對化合物17 進行二級質譜分析，產生碎片離子m/z 575[M-H-162-2H]-，繼續(xù)失去鼠李糖（146 u）產生m/z 429，285，山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷。

化合物27 準分子離子峰[M-H]-為m/z 507，精確相對分子質量可推測其最可能的分子式為C23H13O13。在二級質譜裂解過程中m/z 507 準分子離子峰丟失一分子葡萄糖殘基產生m/z 345[MH-162]-和m/z 344[M-H-162-H]-，同時糖苷配基離子m/z 344 相對豐度顯著高于m/z 345，說明糖苷位于3-號位；m/z 344 進一步中性丟失CH3產生m/z 329，其為典型的丁香亭糖苷碎片峰，根據相對分子質量與相關文獻[23-24，26]，推測其為丁香亭-3-O-葡糖苷。

化合物16 準分子離子峰[M-H]-為m/z 555，推測其分子式為C20H31O16N2。根據相對分子質量推測其為一種未知氨基酸酰胺類化合物。

3 結論

采用UHPLC-LTQ-Orbitrap 高分辨質譜技術對黃花菜的化學成分進行分析，通過結合多級質譜裂解規(guī)律和相關文獻報道，共鑒定出27 個組分，包括酚酸類化合物12 個，黃酮醇類15 個及其它類1 個。該方法可高效、快速、靈敏、全面地分析黃花菜的化學成分，可實現(xiàn)酚酸及黃酮類不同化合物的鑒別，為探討黃花菜的藥效物質基礎提供理論基礎，也為類似化合物的結構鑒定提供依據。