歐海玲 張秀玲 孫平良 張錫流耿曙光 覃宇周

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，我國胃癌發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位，死亡率居第二位［1］。手術(shù)、化療是胃癌的常用治療手段，但患者的總體治療效果并不理想，5年生存率為25%～30%［2］，其中約50%的患者最終因腹腔種植轉(zhuǎn)移死亡［3］。因此，尋找新的治療藥物和治療途徑是胃癌研究的熱點。近年來，天然植物中的多糖成分由于其抗腫瘤作用具有高效低毒的特點而越來越受到重視。馬齒莧多糖與其他植物多糖一樣，作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，除了具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化等作用外，還具有殺滅肝癌、宮頸癌等腫瘤細胞作用［4-6］。本研究主要探討馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞增殖和凋亡的影響，為尋求新的胃癌治療藥物提供基礎(chǔ)理論和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞來源及主要試劑與設(shè)備

胃癌SGC7901細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；馬齒莧多糖由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提取和分離；5-氟尿嘧啶（5-FU）購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購自Bioswamp公司；超凈工作臺購自蘇州金凈凈化設(shè)備公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱、移液器、酶標儀均購自Thermo公司；顯微鏡購自Nikon公司；流式細胞儀購自BECKMAN公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 胃癌SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時，取生長狀態(tài)穩(wěn)定，呈對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰酶消化，加入RPMI 1640培養(yǎng)液將細胞吹打均勻，調(diào)整細胞至適當濃度后移入新的培養(yǎng)瓶中，3～4 d傳代1次。實驗分為馬齒莧多糖組、陰性對照組及陽性對照組（5-FU組），其中馬齒莧多糖組濃度依次為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL。

1.2.2 MTT法檢測胃癌SGC7901細胞增殖情況 收集對數(shù)生長期的胃癌SGC7901細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為 2×105/mL，接種于96 孔板中，置于37 °C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后處理細胞，馬齒莧多糖組加入相應(yīng)濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）的馬齒莧多糖液，陰性對照組加入0.9% NaCl溶液，5-FU組加入2.5 μg/mL濃度的5-FU，分別處理 12 h、24 h、36 h、48 h；吸去上清液，加入新鮮培養(yǎng)液，再加20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；再次吸去上清液，每孔加入150 μL Formazan溶解液，搖床上低速振蕩10 min，然后在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度值（OD）并計算細胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-用藥組OD值/對照組OD值）×100%。實驗重復(fù)6次。

1.2.3 流式細胞儀檢測胃癌SGC7901細胞凋亡情況 取對數(shù)生長期狀況良好的胃癌SGC7901細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為2×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，待單層細胞長至約80%時，按組處理細胞，馬齒莧多糖組加入相應(yīng)濃度的馬齒莧多糖液，陰性對照組加入0.9% NaCl溶液，5-FU組加入2.5 μg/mL濃度的5-FU，分別處理 12 h、24 h、36 h、48 h；收集細胞，離心棄上清液，PBS 洗滌 3 次；加入 10 μL Annexin V-FITC 和 10 μL PI，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。以藥物作用48 h的細胞增殖抑制率及凋亡率為主要評價指標，細胞增殖抑制率以計量資料［均數(shù)±標準差（±s）］表示，多組樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用Scheffe法檢驗。細胞凋亡率組間比較采用χ2檢測，多重比較采用Bonferroni檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 的馬齒莧多糖均可抑制胃癌SGC7901細胞增殖（P＜0.05），且細胞增殖抑制率隨著作用時間的延長和藥物濃度的提高而升高，其中藥物作用48 h時，各濃度馬齒莧多糖組的增殖抑制率均較前明顯增加，其中200 μg/mL、300 μg/mL馬齒莧多糖組增殖抑制率與5-FU組相當（P＞0.05）。見表 1和圖 1。

表1 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

表1 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細胞的增殖抑制率（±s）Tab.1 The proliferation inhibition rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（±s）

aP＞0.05，vs the 5-FU group；bP＜0.05，vs the 5-FU group；cP＜0.05，vs thenegative control group

Proliferation inhibition rate（%）12 h 24 h 36 h 48 h Negative control 0 0 0 0 Group 5-FU 13.83±2.94c 29.83±3.54c 42.89±3.45c 56.36±3.26c 25 μg/mL 2.17±1.27bc 20.51±1.24bc28.35±1.49bc 38.01±1.33bc 50 μg/mL 10.23±2.58bc 24.05±4.56bc34.01±2.46bc 41.05±3.85bc 100 μg/mL 16.98±1.28ac 32.39±1.34bc42.85±5.57ac 51.05±1.57bc 200 μg/mL 24.01±4.76bc 37.01±3.28bc48.65±2.06bc 53.02±2.46ac 300 μg/mL 28.57±2.13bc 42.01±1.34bc51.99±1.04bc 57.20±2.14ac

圖1 不同濃度馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞增殖的影響Fig.1 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the proliferation of gastric cancer SGC7901 cells

2.2 馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，藥物作用48 h時，陰性對照組和5-FU組細胞凋亡率分別為0.73%和47.39%，不同濃度（25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL） 馬齒莧多糖組細胞凋亡率依次為 31.92%、38.39%、40.45%、48.49%、55.71%。與陰性對照組比較，各濃度馬齒莧多糖組的細胞凋亡率均明顯升高（均P＜0.05），且隨著馬齒莧多糖濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升；與5-FU組比較，200 μg/mL濃度組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 組細胞凋亡率降低，而 300 μg/mL組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 不同濃度馬齒莧多糖作用胃癌SGC7901細胞的凋亡率（%）Tab.2 The apoptosis rates of gastric cancer SGC7901 cells treated with different concentrations of portulaca oleracea polysaccharide（%）

3 討論

我國胃癌具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高，而早診率低的特點，化療是胃癌綜合治療方案的重要組成部分，但化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時也會對正常組織造成傷害，致使部分患者難以耐受其毒性作用而終止治療，治療效果受到明顯影響。近年來，從天然植物中提取多糖類物質(zhì)用于抗腫瘤活性的研究已有不少報道。植物多糖作為生物反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，主要通過增強凋亡途徑、氧化呼吸功能途徑和體內(nèi)的免疫應(yīng)答等殺傷腫瘤細胞［7］，對正常組織損傷較小。因此，若能篩選對胃癌細胞具有殺傷效應(yīng)的植物多糖，則有望改善胃癌的治療效果。

圖2 48 h后不同濃度馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of portulaca oleracea polysaccharide at different concentrations on the apoptosis of gastric cancer SGC7901 cells after 48h

馬齒莧屬馬齒莧科植物，廣泛分布在熱帶、溫帶地區(qū)，為藥食同源的野生植物，含有豐富的化學(xué)成分，包括生物堿、黃酮類、有機酸、苷類、萜類、多糖等。藥理研究顯示馬齒莧具有降血脂、降血糖、抗動脈粥樣硬化、抗菌、抗氧化、防衰老、增強免疫以及抗腫瘤等作用［8-10］。其中馬齒莧多糖便是有效的活性成分之一，目前也有少量研究初步探討對馬齒莧多糖抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。胡慶娟等［5］研究報道馬齒莧多糖可顯著降低肝癌HepG2細胞存活率，且促進細胞凋亡。牛廣財?shù)龋?1］也發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖POPⅡ和POPⅢ均能顯著抑制荷Lewis肺癌小鼠的瘤體生長，且可提高荷Lewis肺癌小鼠NK細胞及淋巴細胞轉(zhuǎn)化的活性。在宮頸癌移植瘤中也發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠抑制移植瘤生長，誘導(dǎo)癌細胞凋亡［12］；且能增強宮頸癌荷瘤小鼠細胞免疫功能，對小鼠U14宮頸癌實體瘤和腹水瘤可發(fā)揮抑制作用［6，13］。但馬齒莧多糖與胃癌的研究鮮見報道。本研究用馬齒莧多糖液干預(yù)胃癌SGC7901 細胞 48 h 后，發(fā)現(xiàn) 200 μg/mL、300 μg/mL馬齒莧多糖組增殖抑制率可達（53.02±2.46）%、（57.20±2.14）%，而一般抑制率＞30%則認為抗腫瘤有效，因此提示在胃癌中馬齒莧多糖同樣顯示了可抑制腫瘤細胞增殖的效果，與上述研究結(jié)果一致。此外，因5-FU是目前臨床上用于消化道腫瘤化療的有效藥物之一，本研究進一步采用5-FU作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上濃度馬齒莧多糖處理與5-FU處理的細胞增殖抑制率相當，再次說明高濃度馬齒莧多糖的抑瘤活性與5-FU相當。本研究還發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖組隨著藥物濃度的增加，細胞凋亡率逐漸上升，處理48 h，300 μg/mL馬齒莧多糖組的胃癌SGC7901細胞凋亡率達到55.71%，明顯高于5-FU組的47.38%，說明馬齒莧多糖可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡達到抗腫瘤目的。目前也有研究報道馬齒莧多糖通過降低線粒體膜電位、增加細胞內(nèi)的鈣離子濃度、提高p53和Bax的基因及蛋白表達促進細胞凋亡［5］。但是，馬齒莧多糖對胃癌SGC7901細胞的增殖抑制及誘導(dǎo)細胞凋亡的作用機制尚未知，有待后續(xù)進一步深入研究。