劉司南 龍云祥 高潔 王錚， 劉昌， 黃啟超 林婷

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，居全球癌癥相關(guān)性死亡原因的第二位［1］。因此，對乳腺癌患者總體預(yù)后的研究有重要意義，其中循環(huán)腫瘤標志物在乳腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后中的價值也成為研究的方向之一［2］。核糖體 S6蛋白激酶（ribosomal S6 protein kinase，RSK）家族是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）的重要效應(yīng)因子，可調(diào)節(jié)細胞遷移、增殖和存活等關(guān)鍵過程［3］。有研究發(fā)現(xiàn)RSK1具有抗癌和促癌雙重作用。然而，RSK1在乳腺癌中的作用尚存爭議［4］。ZHAO 等［5］檢測 RSK1、RSK2 和RSK3蛋白在乳腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)RSK1在乳腺癌組織中低表達。然而，SMITH等［6］研究卻發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，乳腺腫瘤組織中RSK1表達水平升高約50%。而且目前RSK1對乳腺癌患者總體預(yù)后影響的相關(guān)研究較少。本研究通過基于大樣本乳腺癌基因組及蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，分析RSK1 mRNA和蛋白表達水平對乳腺癌患者總體預(yù)后的影響，探討其作為乳腺癌總體預(yù)后標志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

乳腺癌患者基因表達相關(guān)數(shù)據(jù)來源于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)集及GEO數(shù)據(jù)集。其中，TCGA數(shù)據(jù)通過TCGAAssembler 2.0.6軟件從癌癥和腫瘤基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載，共納入1 089例乳腺癌患者RNA-seq測序結(jié)果，其中女性1 077例，男性12例；中位年齡58歲（范圍：49～68歲）；Ⅰ～Ⅱ期 800例（73.5%），Ⅲ～Ⅳ期266例（24.4%）。GEO數(shù)據(jù)集共納入9個獨立研究（GSE20685、GSE3494、GSE7390、GSE1456、GSE45255、GSE16446、GSE42568、GSE20711 和 GSE37946），共計1 393例乳腺癌樣本。上述9個GEO數(shù)據(jù)集均基于Affymetrix基因芯片平臺。同時，從TCGA-RPPA蛋白表達數(shù)據(jù)庫中獲得RSK1蛋白表達數(shù)據(jù)。從Protein Atlas數(shù)據(jù)庫獲取腫瘤以及正常組織中RSK1蛋白免疫組化染色數(shù)據(jù)。

從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中提取患者基本信息、總生存期（overall survival，OS）以及生存狀態(tài)。去除生存時間不正確或缺失數(shù)據(jù)，以及非乳腺癌患者數(shù)據(jù)，最終將上述臨床信息與乳腺癌標本生物學(xué)數(shù)據(jù)匹配。以RSK1表達中位數(shù)作為截點值將患者分為RSK1高表達組和低表達組，比較兩組患者總體預(yù)后。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Stata 15.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。分類數(shù)據(jù)采用n（%）表示。分類資料的組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。生存曲線分析采用Kaplan-Meier，組間比較采用Log-rank檢驗。采用Cox回歸模型分析RSK1與乳腺癌患者OS的關(guān)系，并計算風險比（HR）及其對應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析RSK1蛋白在乳腺癌組織中的表達

Protein Atlas數(shù)據(jù)庫的RSK1免疫組化染色結(jié)果顯示，RSK1蛋白主要表達于乳腺上皮細胞，并且在乳腺癌組織中表達水平較低，見圖1。

圖1 RSK1蛋白在乳腺癌組織和正常組織中的表達Fig.1 Expression of RSK1 protein in breast cancer tissues and normal tissues

2.2 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析RSK1 mRNA以及蛋白表達水平與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系

2.2.1 RSK1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 以O(shè)S為終點事件，以RSK1 mRNA表達中位數(shù)9.89為截斷值將患者分為RSK1 mRNA低表達組（545例）和RSK1 mRNA高表達組（544例）。其中RSK1 mRNA表達與患者的HER2基因表達水平及N分期（區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)（P＜0.05），而與性別、年齡、臨床分期、病理類型等均無關(guān)（P＞0.05），見表 1。

表1 RSK1 mRNA表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Tab.1 Relationship between RSK1 mRNA expression and clinicopathological characteristics of breast cancer patients［n（%）］

2.2.2 生存分析 基于TCGA-BRCA數(shù)據(jù)庫的生存分析結(jié)果顯示，RSK1 mRNA高表達和低表達乳腺癌患者的中位生存時間分別為148.5個月和113.6個月，高表達患者總體預(yù)后較好（HR=0.650，95% CI：0.47～0.89，P=0.007），見圖2A。進一步分層分析發(fā)現(xiàn)，女性、年齡≤60歲、Ⅰ～Ⅱ期、浸潤性乳腺癌、無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）以及無遠處轉(zhuǎn)移（M0）的患者RSK1 mRNA高表達時預(yù)后較好，見表2?；赥CGA-RPPA數(shù)據(jù)庫分析407例有RSK1蛋白表達數(shù)據(jù)的乳腺癌患者總體預(yù)后信息，結(jié)果顯示，RSK1蛋白高表達患者的總體預(yù)后優(yōu)于RSK1低表達患者（HR=0.49，95% CI：0.27～0.89，P=0.011），見圖 2B。

圖2 RSK1表達與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between RSK1 expression and overall survival in patients with breast cancer

基于TCGA-BRCA以及TCGA-RPPA數(shù)據(jù)庫分別對早期（Ⅰ～Ⅱ期）和晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者RSK1 mRNA和蛋白表達與總體預(yù)后的關(guān)系進行分層分析。結(jié)果顯示，早期患者中RSK1 mRNA高表達組總體預(yù)后較好（HR=0.61，95% CI：0.39～0.95，P=0.025）；RSK1 蛋白高表達組總體預(yù)后亦優(yōu)于低表達組（HR=0.43，95% CI：0.22～0.84，P=0.008）。而晚期乳腺癌患者中，RSK1 mRNA和蛋白高表達和低表達患者的總體預(yù)后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（HR=1.03，95% CI：0.74～1.43，P=0.87；HR=0.89，95% CI：0.45～1.74，P=0.72）。

2.2.3 RSK1 mRNA與乳腺癌患者OS的關(guān)系 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡、臨床分期、T分期、N分期、RSK1 mRNA表達水平與乳腺癌患者OS有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡＞60歲（HR=2.149，95% CI：1.487～3.108，P＜0.001）、臨床分期Ⅲ～Ⅳ期（HR=2.663，95% CI：1.547～4.586，P＜0.001）是影響乳腺癌患者OS的危險因素，而RSK1 mRNA高表達（HR=0.621，95% CI：0.425～0.907，P=0.014）是影響乳腺癌患者OS的保護因素。見表3。

2.3 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析RSK1 mRNA與乳腺癌總體預(yù)后的關(guān)系

9個GEO芯片數(shù)據(jù)薈萃分析顯示，RSK1 mRNA高表達組患者總體預(yù)后較好（HR=0.69，95% CI：0.56～0.86，P=0.002），與TCGA-BRCA數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。對GEO數(shù)據(jù)庫中的9個數(shù)據(jù)集分別進行生存分析，結(jié)果顯示7項研究中高表達RSK1的患者預(yù)后較好，但只有樣本量大于300的GSE20685研究差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而GSE1456數(shù)據(jù)和GSE16446數(shù)據(jù)研究中高表達患者的預(yù)后較低表達者差（HR=1.38，95% CI：0.73～2.63，P=0.304；HR=8.40，95% CI：2.96～23.9，P=0.012）。見圖3～4。

表2 乳腺癌患者RSK1 mRNA表達與OS的分層分析Tab.2 Stratified analysis of RSK1 mRNA expression and OS in breast cancer patients

表3 影響乳腺癌患者OS的單因素及多因素分析Tab.3 Univariable and multivariable analysis of prognostic factors for OS in breast cancer patients

圖3 GEO數(shù)據(jù)庫中RSK1 mRNA表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Fig.3 Relationship between the expression of RSK1 mRNA and the prognosis of breast cancer in the GEO database

圖4 RSK1 mRNA表達與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系Fig.4 Relationship between the expression of RSK1 mRNA and the prognosis of breast cancer

3 討論

RSK 家族包括 RSK1、RSK2、RSK3 和 RSK4，其中，RSK1-3 mRNA在所有細胞系和組織中表達，而RSK4 mRNA主要在胚胎發(fā)育過程中表達［3］。該家族具有高度保守的功能基序和序列同源性，含有N端激酶結(jié)構(gòu)域（NTKD）和C端激酶結(jié)構(gòu)域（CTKD），前者可調(diào)節(jié)RSK的激活，而后者負責底物磷酸化。RSK可調(diào)節(jié)多種與細胞存活、生長和增殖有關(guān)的底物，但是既往研究中關(guān)于RSK1在乳腺癌中的作用并不一致。部分研究顯示RSK1發(fā)揮促癌作用，CZAPLINSKA等［7］構(gòu)建三陰性乳腺癌小鼠模型，觀察腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移的形成情況，結(jié)果35 d后發(fā)現(xiàn)所有接種對照細胞的小鼠均成瘤，而在注射RSK1陰性細胞組中僅有75%的荷瘤小鼠，且RSK1陰性小鼠的平均腫瘤質(zhì)量明顯較陽性小鼠降低（0.37 g vs 1.16 g，P＜0.0001），RSK1陰性小鼠在肺表面的轉(zhuǎn)移灶亦減少了約85%（P＜0.001），說明RSK1促進了不依賴錨定的細胞生長和遷移。LUDWIK等［8］在三陰性乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)中，癌細胞增殖、存活和運動均需要RSK的參與，沉默或抑制RSK1可抑制癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和定植。后續(xù)研究中報告了一種新型RSK1/2抑制劑SL0101類似物，認為沉默RSK1和RSK2可進一步抑制三陰性乳腺癌細胞系存活或增殖能力。還有研究發(fā)現(xiàn)在基底樣乳腺癌中，RSK1可激活Y-Box結(jié)合蛋白-1（Y-box binding protein-1，YB-1）［9］，而 YB-1 已被證明在基底樣乳腺癌中的表達比例較高［10］，且與乳腺癌高復(fù)發(fā)率有關(guān)［11］，在乳腺癌細胞中過表達可導(dǎo)致單層細胞增殖和錨定非依賴性生長增強［12］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制RSK可通過滅活三陰性乳腺癌中的YB-1消除腫瘤起始細胞，從而抑制腫瘤生長［13］。然而，也有相關(guān)研究認為RSK1具有抗腫瘤作用。LARA等［14］報道RSK1是非小細胞肺癌進展的負調(diào)節(jié)劑，在繼發(fā)性病變與原發(fā)性病變中，RSK1表達降低，且敲低RSK1可增強細胞遷移能力（RSK2和RSK4的敲低具有相反作用），并導(dǎo)致A549肺癌細胞在體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移。ZHAO等［5］發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中RSK1表達下調(diào)，且RSK1轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤等級、TNM分級和分期呈負相關(guān)。本研究基于TCGA、GEO以及Protein Atlas數(shù)據(jù)分析RSK1在乳腺癌中的表達及其預(yù)后預(yù)測價值。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示乳腺癌組織中RSK1蛋白表達水平低于正常乳腺組織，且TCGA數(shù)據(jù)庫分析RSK1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RSK1 mRNA表達與HER2基因表達水平及N分期（區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）有關(guān)，且高表達患者的預(yù)后較好，進一步的Cox回歸分析同樣顯示RSK1 mRNA高表達是預(yù)后的保護因素。進一步分層分析亦發(fā)現(xiàn)在女性、年齡≤60歲、Ⅰ～Ⅱ期、浸潤性乳腺癌、無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）以及無遠處轉(zhuǎn)移（M0）患者中RSK1 mRNA高表達是保護因素?；赥CGA-RPPA數(shù)據(jù)庫分析RSK1蛋白高低表達患者的生存情況，也支持RSK1高表達是乳腺癌預(yù)后的保護因素這一結(jié)論。因此認為，RSK1有望成為乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測的標志物。

但是，本研究結(jié)論與上述部分研究［7-14］結(jié)果有所差異，分析可能原因是上述研究更多為基礎(chǔ)實驗探索，同時缺乏大樣本臨床研究驗證，因此可能導(dǎo)致以往研究未發(fā)現(xiàn)RSK1對乳腺癌總體預(yù)后評估的價值。本研究中納入的 7 項（GSE20685、GSE3494、GSE7390、GSE45255、GSE42568、GSE20711 和 GSE37946） 研究均支持高表達RSK1是乳腺癌總體預(yù)后保護因素，但是也只有樣本量大于300例的GSE20685研究得到統(tǒng)計學(xué)陽性結(jié)果，一定程度上也說明樣本量可能是造成陰性結(jié)果的原因。本研究還發(fā)現(xiàn)RSK1高表達可作為早期乳腺癌患者的預(yù)后保護因素，而在晚期患者中，RSK1低表達組預(yù)后較好，但也未能得到陽性的統(tǒng)計學(xué)結(jié)果。因此，盡管本研究基于大樣本進行數(shù)據(jù)分析，但是納入的乳腺癌樣本大部分基于歐美人群，且單一指標對乳腺癌總體預(yù)后評估有限，同時也還缺乏大樣本的臨床數(shù)據(jù)驗證，因此本研究結(jié)果是否適用于我國乳腺癌患者，以及后期聯(lián)合其他指標是否能進一步提高總體預(yù)后評估價值仍需進一步研究。