關(guān)高娃 馬曉 司海王婧婷 張新紅 路澤軍 曹邦偉

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)居第3位，在我國CRC發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)［1］。近年來，盡管結(jié)腸癌的總體療效有所改善，但死亡率仍較高［2］。缺乏早期診斷和有效的預(yù)后預(yù)測(cè)手段是患者死亡的重要原因。因此，鑒定新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物對(duì)改善患者生存至關(guān)重要。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，與細(xì)胞周期蛋白激酶CDK4/6結(jié)合促使細(xì)胞周期由G1期向S期的過渡，促進(jìn)細(xì)胞增殖［3］。目前研究顯示Cyclin D1在腫瘤中的作用不明確［4-6］。在結(jié)腸癌中同樣發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，有研究報(bào)道Cyclin D1高表達(dá)是預(yù)后不良的因素［7］，但亦有研究認(rèn)為是預(yù)后保護(hù)因素［8］，還有研究認(rèn)為與預(yù)后無關(guān)［9］。錯(cuò)配修復(fù)（mis-match repair，MMR）是一種基因錯(cuò)配修復(fù)體系，錯(cuò)配修復(fù)基因完整（pMMR）可確保DNA復(fù)制過程的準(zhǔn)確性，而當(dāng)錯(cuò)配修復(fù)基因缺失（dMMR）時(shí)不能修復(fù)錯(cuò)配的堿基，致使DNA遺傳不穩(wěn)定而引發(fā)腫瘤［10］。其中10%～20%的CRC由MMR缺失造成，且在Ⅱ期CRC中dMMR為預(yù)后良好指標(biāo)［11］，然而也有研究認(rèn)為無預(yù)后意義［12-13］。纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）是肝細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，可與細(xì)胞生長因子結(jié)合而促進(jìn)腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［14-15］。但是目前三者與結(jié)腸癌預(yù)后的關(guān)系并不明確，本研究結(jié)合三項(xiàng)指標(biāo)在腫瘤中的作用，檢測(cè)其在210例結(jié)腸癌患者術(shù)后組織標(biāo)本中的表達(dá)，并分析三者表達(dá)的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)提供新的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年5月—2019年5月中國人民解放軍第六醫(yī)學(xué)中心行結(jié)腸癌根治術(shù)患者的病理組織蠟塊標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)組織病理學(xué)診斷為結(jié)腸癌；⑵首次手術(shù)，且術(shù)前未行放化療；⑶隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡≤18歲或者＞85歲患者；⑵合并其他原發(fā)惡性腫瘤；⑶合并嚴(yán)重心肺疾病。最終納入210例，中位年齡為65歲（范圍：29～84歲），≤65歲患者102例；男性122例；原發(fā)部位：左半結(jié)腸癌109例，右半結(jié)腸癌101例；腺癌133例，混合型（含黏液或印戒成分）77例；高中分化151例，低分化59例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移112例；根據(jù)2010 AJCC/UICC CRC pTNM分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期89例，Ⅲ期91例，Ⅳ期24例。本研究經(jīng)中國人民解放軍第六醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)通過。

1.2 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸癌組織中Cyclin D1的表達(dá)及MMR的缺失情況

所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。免疫組化采用MaxVision-TM3法，石蠟切片脫蠟、水化并沖洗，用pH 9.0的EDTA修復(fù)液進(jìn)行水煮加熱抗原修復(fù)。一抗為兔抗人Cyclin D1、二抗為MaxVisionTM3/HRP試劑，4種MMR蛋白一抗依次為 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2 抗體試劑，二抗為OptiView DAB kit試劑。DAB顯色，復(fù)染并封固。Cyclin D1定位于細(xì)胞核為陽性。染色強(qiáng)度評(píng)分：無著色計(jì)0分、淡黃色計(jì)1分、棕黃色計(jì)2分、深褐色計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：著色細(xì)胞數(shù)≤5%計(jì)0分、6%～25%計(jì)1分、26%～50%計(jì)2分、51%～75%計(jì)3分、≥76%計(jì)4分。兩者得分相乘，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。將得分≤4分定義為Cyclin D1低表達(dá)，≥5 分為高表達(dá)。通過檢測(cè) MLH1、MSH2、MSH6、PMS2等4種蛋白判定MMR缺失情況，4者均定位于細(xì)胞核為陽性，陰性則定義為蛋白缺失，其中任何一個(gè)蛋白缺失即為dMMR，均無缺失為pMMR。

1.3 凝固法檢測(cè)FIB的濃度

以血凝專用硅化真空管采集患者術(shù)前靜脈血3 mL（枸櫞酸鈉與待測(cè)血液以1∶9比例混勻抗凝），離心10 min，2 h內(nèi)以全自動(dòng)凝血儀進(jìn)行檢驗(yàn)。FIB參考值為1.8～4.0 ng/mL，在此范圍內(nèi)數(shù)值定義為正常組，F(xiàn)IB＞4 ng/mL定義為異常組，本研究中無FIB＜1.8 ng/mL數(shù)據(jù)。

1.4 隨訪

采用門診、住院及電話等方式隨訪。術(shù)后2年每隔3個(gè)月隨訪1次，之后每隔6個(gè)月隨訪1次。復(fù)查腸鏡、胸腹部增強(qiáng)CT、消化道腫瘤標(biāo)志物及便潛血等。中位隨訪34個(gè)月（范圍：7～60個(gè)月），隨訪截止時(shí)間為2019年12月，隨訪率為100%。隨訪終點(diǎn)是患者死亡，隨訪期間死亡59例?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為術(shù)后至患者因任何原因死亡的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類數(shù)據(jù)組間比較采用χ2檢驗(yàn)，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步行phi檢驗(yàn)分析兩者相關(guān)方向及程度；采用Kaplan-Meier法計(jì)算累積生存率，采用Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存曲線的差異；采用Cox回歸分析影響OS的因素。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中Cyclin D1、MMR的表達(dá)及FIB檢測(cè)結(jié)果

免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，210例結(jié)腸癌患者術(shù)后石蠟標(biāo)本Cyclin D1、MMR表達(dá)陽性均定位于細(xì)胞核。Cyclin D1低表達(dá)126例（60.0%），高表達(dá)84例（40.0%），見圖1；dMMR 27例（12.9%），pMMR 183例（87.1%），見圖2。靜脈血檢測(cè)FIB結(jié)果顯示，正常組患者125例（59.5%），異常組患者85例（40.5%）。

圖1 Cyclin D1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（×200）Fig.1 Expression of Cyclin D1 in colon cancer tissues（×200）

圖2 MMR在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（×200）Fig.2 Expression of MMR in colon cancer tissues（×200）

2.2 Cyclin D1、MMR、FIB與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系

CyclinD1與病理類型、pTNM分期有關(guān)（均P＜0.05），MMR與原發(fā)灶部位、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期有關(guān)（均P＜0.05），F(xiàn)IB與分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期相關(guān)（均P＜0.05），見表1。

2.3 結(jié)腸癌組織中Cyclin D1、MMR、FIB的相關(guān)性

Cyclin D1與 FIB 表達(dá)相關(guān)（χ2=8.235，P=0.004），phi檢驗(yàn)示Cyclin D1與FIB呈正相關(guān)，相關(guān)強(qiáng)度一般（r=0.198，P=0.004）；未發(fā)現(xiàn) Cyclin D1和 FIB 與MMR有關(guān)（χ2=0.857，P=0.355；χ2=0.757，P=0.384）。

2.4 Cyclin D1、MMR、FIB與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier法結(jié)果顯示，Cyclin D1低表達(dá)組患者1年、3年、5年生存率分別為92.1%、84.9%、80.2%，Cyclin D1高表達(dá)組分別為82.1%、67.9%、59.5%，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=9.878，P=0.002），見圖 3A；dMMR 組患者 1 年、3 年、5年生存率分別為96.3%、92.6%、92.6%，pMMR組分別為86.9%、76.0%、68.9%，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank χ2=5.138，P=0.023），見圖 3B；FIB正常組患者1年、3年、5年生存率分別為92.0%、85.6%、81.6%，F(xiàn)IB異常組分別為 82.4%、67.1%、57.6%，兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Logrank χ2=9.490，P=0.002），見圖 3C。

單因素Cox回歸分析結(jié)果示，分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM 分期、Cyclin D1、MMR、FIB 與結(jié)腸癌患者OS有關(guān)（均P＜0.05），其中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ+Ⅳ期、Cyclin D1高表達(dá)、pMMR及FIB異常的患者OS較差?？紤]年齡及原發(fā)位置對(duì)結(jié)腸癌預(yù)后有影響，故將兩者一并納入多因素Cox回歸進(jìn)行分析，結(jié)果顯示右半結(jié)腸癌、pTNM分期Ⅲ+Ⅳ期、Cyclin D1高表達(dá)及FIB異常的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)均較高（P＜0.05）。見表 2。

3 討論

結(jié)腸癌易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療難，死亡率高。近年研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1與腫瘤形成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。FUSTé等［16］報(bào)道Cyclin D1高表達(dá)可通過激活樁蛋白（Paxillin）磷酸化和7號(hào)染色體基因RAC1而增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力。Cyclin D1也可促使細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期，其高表達(dá)時(shí)大量細(xì)胞進(jìn)入S期從而縮短細(xì)胞周期進(jìn)程、加速增殖［17］。OGINO等［8］檢測(cè)Cyclin D1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)1/3以上的患者過表達(dá)。本研究檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者中亦表達(dá)Cyclin D1，其中高表達(dá)率為40.0%，且Cyclin D1高表達(dá)的患者病理多為混合型、且分期較晚?？紤]可能與混合型含有黏液及印戒成分，而此類腫瘤浸潤程度更深，脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高有關(guān)。進(jìn)一步行生存分析也發(fā)現(xiàn)Cyclin D1高表達(dá)為不良預(yù)后獨(dú)立因素，高表達(dá)患者生存率明顯下降，同樣與既往研究結(jié)果一致［7，18］。然而，也有研究認(rèn)為 Cyclin D1 高表達(dá)的患者預(yù)后較好［8］，可能是由于Cyclin D1不同亞型（Cyclin D1a/b）的致癌能力不同從而導(dǎo)致研究結(jié)果不同，其中已有研究證實(shí)Cyclin D1b亞型的致癌能力高于Cyclin D1a［19］，而既往研究以及本研究均未區(qū)分亞型，這可能是導(dǎo)致研究不同的原因。

表1 Cyclin D1、MMR、FIB與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系Tab.1 Relationship between Cyclin D1,MMR,FIB and clinicopathological parameters of colon cancer patients

圖3 Cyclin D1、MMR、FIB與結(jié)腸癌患者生存曲線圖Fig.3 Survival curves of colon cancer patients with Cyclin D1,MMR and FIB

表2 影響結(jié)腸癌預(yù)后的單因素和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analysis of the prognosis of colon cancer

高凝狀態(tài)與惡性腫瘤密切相關(guān)，含F(xiàn)IB的血管內(nèi)皮生長因子可促進(jìn)血管生成，從而為腫瘤生長提供條件，F(xiàn)IB還能提供腫瘤細(xì)胞遷移的基質(zhì)并通過與黏附分子和整聯(lián)蛋白的相互作用促進(jìn)細(xì)胞遷移［20］，同時(shí)可以保護(hù)癌細(xì)胞逃避天然殺傷細(xì)胞的清除［21］。本研究檢測(cè)結(jié)腸癌患者外周血FIB的濃度，異常比例為40.5%，且FIB異?；颊吲c低分化、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、分期較晚有關(guān)，1年、3年、5年生存率較FIB正常患者明顯下降，單因素和多因素分析也顯示FIB異常為預(yù)后不良的獨(dú)立因素，與以往研究結(jié)果一致［21-22］。此外，F(xiàn)IB具有采樣方便、價(jià)格低廉、可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，因此可能是判斷結(jié)腸癌預(yù)后的理想標(biāo)志。但同時(shí)也應(yīng)考慮FIB易受炎癥、血栓性疾病等多種因素影響，今后尚需開展研究進(jìn)一步排除干擾因素的影響，證實(shí)其價(jià)值。

MMR可保證DNA復(fù)制精度及正確修復(fù)，其缺失導(dǎo)致基因復(fù)制過程中錯(cuò)誤的累積而致癌。有研究報(bào)道10%～20%的CRC由MMR缺失造成［11］。本研究中結(jié)腸癌患者的dMMR發(fā)生率為12.9%，且dMMR的患者原發(fā)病灶多位于右半，表現(xiàn)為低分化、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、分期較早，以往研究亦發(fā)現(xiàn)上述特點(diǎn)［11-12］。右半結(jié)腸癌主要源于中腸、多為CMS1型，基因突變率較高，可能為dMMR多發(fā)生在右半結(jié)腸的原因。在生存方面，目前的研究大多在Ⅱ期結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)dMMR為預(yù)后良好的因素［23］，在其他分期中的意義并不明確［11-13］。本研究在整體分期中也發(fā)現(xiàn)dMMR的患者生存率較pMMR患者高，但因樣本量有限未行不同分期亞組分析，且在單因素和多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)dMMR不是結(jié)腸癌的獨(dú)立預(yù)后因素。

本研究還分析三者表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cyclin D1表達(dá)與FIB相關(guān)，但與MMR表達(dá)并不相關(guān)。如前所述FIB可與生長因子結(jié)合促進(jìn)腫瘤血管生成［20］，而Cyclin D1受到生長因子信號(hào)后激活可引起一系列反應(yīng)從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程［19］，結(jié)果可能共同促進(jìn)了腫瘤增殖，上述Cyclin D1高表達(dá)及術(shù)前FIB異常患者預(yù)后較差也一定程度證實(shí)了這一推測(cè)。而關(guān)于Cyclin D1與MMR表達(dá)的相關(guān)性，理論上，MMR具有修復(fù)錯(cuò)配堿基、確保DNA復(fù)制精度的功能，而Cyclin D1高表達(dá)時(shí)可阻止細(xì)胞周期停滯，使受損DNA繼續(xù)復(fù)制［19］，因此兩者可能存在一定相關(guān)性，但本研究并未發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性，可能與dMMR病例較少有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1高表達(dá)、pMMR及術(shù)前FIB異常的結(jié)腸癌患者OS下降，Cyclin D1、FIB是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，可能是評(píng)估結(jié)腸癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)，但因本研究為回顧性分析且樣本量有限，后續(xù)可擴(kuò)大樣本并設(shè)計(jì)前瞻性研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證。