韋玲春 廖小莉 黃文鋒 廖思娜劉志輝 李永強

原發(fā)性肝癌是我國最常見的癌癥之一，其中90%為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。廣西是肝癌高發(fā)地區(qū)之一，其發(fā)病率和死亡率在廣西惡性腫瘤中分別位居第二位和第一位［1］。肝癌起病隱匿，癥狀不典型，確診時大多已為中晚期，錯失手術(shù)治療的最佳時機。晚期肝癌治療中索拉非尼等分子靶向藥物取得一定療效，但因費用昂貴、部分患者難以耐受等限制了其臨床應(yīng)用［2-3］。傳統(tǒng)化療藥物阿霉素、絲裂霉素等不良反應(yīng)顯著，且未能改善生存期［4］。QIN等［5］研究結(jié)果證實以奧沙利鉑為主的方案可為亞洲患者，特別是我國晚期HCC患者帶來生存獲益，成為晚期肝癌一線系統(tǒng)化療的標準治療。

DNA修復(fù)通路相關(guān)基因多態(tài)性被認為是影響含鉑類方案治療療效的重要因素［6］。Holliday交叉識別蛋白（holliday junction recognition protein，HJURP）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個基因，在DNA修復(fù)、維持染色體穩(wěn)定中具有重要意義［7-8］。研究表明，HJURP基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］，在肺癌、肝癌、乳腺癌等組織中的表達高于正常組織［10-12］，且HJURP基因rs3771333位點多態(tài)性可能與我國肝癌遺傳易感性相關(guān)［13］，但HJURP基因多態(tài)性與HCC治療療效及預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究探討HJURP基因多態(tài)性與含奧沙利鉑方案一線治療晚期HCC近期療效、預(yù)后及不良反應(yīng)的關(guān)系，為HCC患者的預(yù)后評估尋找新的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月—2019年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院治療的HCC患者為研究對象。納入標準：⑴經(jīng)病理組織學(xué)或臨床診斷為HCC；⑵無手術(shù)指征或拒絕手術(shù)及介入等局部治療；⑶化療前ECOG評分為0～2分，均無化療禁忌證；⑷TNM分期Ⅲ～Ⅳ期；⑸自愿接受含奧沙利鉑方案的化療并簽署化療同意書。排除標準：⑴合并其他嚴重基礎(chǔ)疾病或嚴重多器官功能障礙者；⑵合并其他惡性腫瘤；⑶入組前曾接受其他系統(tǒng)治療，如靶向治療及免疫治療等。本研究獲廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 治療方案及劑量調(diào)整方法

入組患者接受含奧沙利鉑聯(lián)合方案化療：奧沙利鉑130 mg/m2，第 1 天；替吉奧 40 mg/m2，分 2 次口服，第1～14天?；熎陂g常規(guī)予5-羥色胺3受體（5-HT3R）止吐，若治療周期中血液學(xué)檢測顯示劑量限制性毒性，則暫停治療，予粒細胞集落刺激因子等治療。

1.3 DNA提取

所有患者均在接受含奧沙利鉑方案化療前空腹抽取5 mL外周靜脈血，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用基因組DNA提取試劑盒，嚴格按照說明提取總DNA，并將提取完成的DNA進行質(zhì)控，Qubit熒光定量進行DNA濃度定量，瓊脂糖凝膠電泳進行DNA純度分析，符合要求的DNA樣本存于-20℃冰箱中備用。

1.4 基因分型

樣本完成提取后將基因組DNA片段化，進行末端修復(fù)，在DNA片段兩端加上已知序列的接頭并引入index標簽構(gòu)建成為測序引物可識別的的全基因組DNA文庫；然后將DNA文庫與探針進行雜交，探針為標記有生物素的單鏈DNA，用于捕獲與其互補的靶序列，雜交孵育完成后，加入鏈霉素標記的磁珠，捕獲靶序列，通過洗脫反應(yīng)去除非靶區(qū)域序列及其他雜質(zhì)，得到含靶區(qū)域捕獲產(chǎn)物的文庫；最后將雜交洗脫后的樣本按照數(shù)據(jù)量比例進行混合并測序。數(shù)據(jù)通過過濾、比對、質(zhì)控后進行突變檢測。

1.5 療效和不良反應(yīng)評價

采用實體瘤療效評價標準（RECIST）1.1版［14］進行療效評價，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進展（PD），其中疾病控制率（DCR）=［（CR+PR+SD）/總例數(shù)］×100%。無進展生存期（PFS）定義為從化療開始到腫瘤發(fā)生進展或因任何原因死亡的時間。總生存期（OS）定義為從化療開始至死亡的時間。根據(jù)美國國家癌癥研究所（NCI）提出的不良事件術(shù)語標準4.0版（CTCAE 4.0）［15］進行分級評價不良反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；采用Logistic回歸模型分析HJURP基因多態(tài)性與疾病控制率的關(guān)系，并校正潛在的混雜因素；采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行生存分析。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的基線資料

共42例晚期HCC患者符合標準納入研究，中位年齡 46歲（范圍：20～68歲）；男性 35例，女性 7例。其余資料詳見表1。

表1 42例晚期HCC患者的臨床資料Tab.1 Characteristics of 42 patients with advanced HCC

2.2 基因分型結(jié)果

所有樣本均分型成功，入選位點基因分型均符合染色體 Hardy-Weinber遺傳平衡規(guī)律（P＞0.05），基因頻率分布見表2。

2.3 HJURP基因多態(tài)性與疾病控制率的關(guān)系

42例患者中獲PR 1例（2.4%）、SD 8例（19.0%）、PD 33例（78.6%）、DCR為21.4%。由于rs10511位點G/G型例數(shù)較少，將A/G+G/G合并分析，同理將rs12582位點C/T+T/T型、rs3821238位點C/G+G/G型、rs3732215位點C/G+G/G型、rs3806589位點G/A+A/A型、rs2286430位點G/A+A/A合并分析。結(jié)果顯示，HJURP基因各位點與DCR無明顯關(guān)系（均P＞0.05）。見表3。

表2 42例晚期HCC患者基因頻率分布Tab.2 Genotype distribution of 42 patients with advanced HCC

2.4 HJURP基因多態(tài)性與PFS及OS的關(guān)系

通過住院、門診復(fù)查或電話隨訪，隨訪截至2019年12月31日，中位隨訪時間為5個月（范圍：2～70個月）。至隨訪結(jié)束，42例患者中，6例存活，34例死亡，2例失訪。全組患者中位無進展生存期（mPFS）為1.5個月（95% CI：1.3～1.7個月）；中位總生存期（mOS）為4.4個月（95% CI：2.1～6.7個月）。rs3771333位點A/A基因型患者mOS為6.0個月（95% CI：1.4～10.6個月），A/C基因型為 1.3個月（95% CI：0.0～3.8個月），A/A 基因型患者mOS較A/C型患者延長4.7個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.819，P=0.016），見圖 1。其余位點各基因亞型間的mPFS及mOS的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表 4。

表3 HJURP基因多態(tài)性與DCR的關(guān)系Tab.3 Relationship between HJURP polymorphism and DCR

2.5 HJURP基因多態(tài)性與化療不良反應(yīng)之間的關(guān)系

所有患者主要不良反應(yīng)主要為血液學(xué)毒性、神經(jīng)毒性、胃腸道毒性等，以Ⅰ～Ⅱ度為主，且經(jīng)對癥治療后均可緩解，未影響后續(xù)治療。其中貧血發(fā)生率最高（50%），但也以輕度為主，僅1例發(fā)生Ⅳ度貧血，經(jīng)輸血等治療后貧血得以改善，未影響后續(xù)治療，其余不良反應(yīng)分布情況見表5。發(fā)生血液毒性組（G1～4）與未發(fā)生血液毒性組（G0）比較，以及發(fā)生輕度（G1～2）與中至重度（G3～4）血液毒性組比較，各基因型頻率在各組內(nèi)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。發(fā)生胃腸道毒性（G1～4）與未發(fā)生胃腸道毒性組（G0），以及發(fā)生神經(jīng)毒性組（G1～4）與未發(fā)生神經(jīng)毒性組（G0）中，各基因型的頻率差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

DNA修復(fù)基因多態(tài)性與DNA修復(fù)能力相關(guān)，可影響含鉑類方案化療療效及預(yù)后［9］。HJURP是近年新發(fā)現(xiàn)的一個基因，在DNA損傷修復(fù)中起重要作用。真核生物DNA雙鏈損傷時，Mre11-Rad50-NBS1（MRN）復(fù)合體可感應(yīng)斷裂的產(chǎn)生，可快速聚集、包繞DAN雙鏈斷裂部位，為雙鏈斷裂的修復(fù)提供框架平臺。且HJURP與MSH5/NBS1相互作用參與了DNA雙鏈斷裂修復(fù)［7］。目前也有研究報道HJURP與肝癌的關(guān)系，HU等［11］檢測了164例肝癌患者組織樣本中的HJURP蛋白表達水平，經(jīng)多因素分析證實，HJURP高表達是不良預(yù)后的獨立危險因素。本課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HJURP中rs3771333位點多態(tài)性可能與中國人肝癌易感性有關(guān)，攜帶C等位基因型為高危易感基因型［13］。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs3771333位點A/A型的患者mOS較A/C型明顯延長，提示攜帶C等位基因型可能與不良預(yù)后相關(guān)。HJURP基因rs3771333位點多態(tài)性表現(xiàn)為編碼HJURP蛋白第568個氨基酸密碼子的第3個堿基發(fā)生A→C轉(zhuǎn)換，相應(yīng)密碼子由GAA轉(zhuǎn)化為GAC，使其編碼的氨基酸由谷氨酸（Glu）轉(zhuǎn)化為天冬氨酸（Asp）。由于不同氨基酸的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能不同，所以這種改變可能導(dǎo)致HJURP蛋白功能的改變，進而影響疾病易感性和預(yù)后。但本研究未發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與患者的DCR有關(guān)，可能原因為入組的病例數(shù)偏少、選擇納入校正的因素及數(shù)量影響了統(tǒng)計結(jié)果。

表4 HJURP基因多態(tài)性與PFS及OS的關(guān)系Tab.4 Relationship between HJURP polymorphism and PFS and OS

圖1 rs377133位點各基因亞型患者總生存曲線Fig.1 Overall survival curves of gene subtypes of rs377133

表5 42例HCC患者不良反應(yīng)發(fā)生情況［n（%）］Tab.5 Adverse effects in 42 patients with HCC［n（%）］

奧沙利鉑引起的不良反應(yīng)可致使患者化療耐受性降低，一定程度上限制了化療藥物劑量從而影響化療療效。因此，篩選用于預(yù)測化療毒性作用的生物學(xué)分子，對化療前及化療期間采取積極的相應(yīng)干預(yù)措施，以預(yù)防化療相關(guān)的嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生具有重要作用。目前以DNA修復(fù)基因多態(tài)性作為預(yù)測化療不良反應(yīng)的生物標志物成為研究的熱點之一，但各研究結(jié)論并不一致，尚存爭議。CORTEJOSO等［16］研究ERCC1基因C118T位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌患者奧沙利鉑化療不良反應(yīng)的關(guān)系，結(jié)果顯示攜帶T等位基因型患者發(fā)生中性粒細胞減少的風(fēng)險較低。但CHEN等［17］報道ERCC1基因C118T位點多態(tài)性與血液毒性無明顯相關(guān)性。本研究中不良反應(yīng)以輕度為主，且未發(fā)現(xiàn)HJURP基因多態(tài)性與晚期HCC患者血液毒性、胃腸道毒性及神經(jīng)毒性發(fā)生相關(guān)。造成陰性結(jié)果可能與本研究樣本量較少、入組患者的病因背景不同有關(guān)，同時患者的年齡、給藥劑量、化療前預(yù)處理方式等不同也可能造成結(jié)局的多樣性，后續(xù)仍需綜合考慮上述因素的影響，擴大樣本量特別是增加有乙肝、肝硬化背景的患者進一步研究。此外，鉑類藥物在體內(nèi)的代謝過程往往是多個基因共同作用的結(jié)果，除了與DNA修復(fù)基因相關(guān)外，代謝酶及轉(zhuǎn)運酶等基因也具有重要作用，因此多基因多態(tài)性聯(lián)合分析可能是未來鉑類藥物相關(guān)不良反應(yīng)的研究方向。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)HJURP基因多態(tài)性在晚期HCC以奧沙利鉑為基礎(chǔ)化療的療效評估中具有潛在的價值，可為晚期HCC的個體化治療提供依據(jù)。但本研究病例數(shù)較少，且患者均來自于同一醫(yī)院，存在選擇偏倚情況，相關(guān)結(jié)論仍有待擴大樣本量進一步研究。