賈壯壯,袁 慶,陳紅陽,張 彤,趙 磊,王少峽,柴麗娟,郭 虹,胡利民

(天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617)

缺血性腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)[1]，其病理機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞凋亡等[2]。細(xì)胞凋亡參與多種疾病病理過程，與腦缺血/再灌注損傷病理機(jī)制有密切聯(lián)系[3]，其中Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)變化過程中，共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[4]。caspase-3作為caspase 家族重要成員參與介導(dǎo)了凋亡的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分。腦缺血/再灌注損傷細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，涉及多條信號通路，其中PI3K/AKT信號通路發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。

中藥丹參、三七為臨床常用活血藥對，二藥配伍后相輔相成，廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。其中丹參主要化學(xué)成分包括水溶性的酚酸類，如丹酚酸B、丹參素、迷迭香酸等，脂溶性的二萜類，如丹參酮，隱丹參酮等[7]；三七的主要活性成分為三七總皂苷[8]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，丹參多酚酸及三七總皂苷可通過減少氧化應(yīng)激損傷、降低炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)障礙等減輕腦缺血/再灌注損傷[9-11]。本文主要通過研究丹參多酚酸配伍三七總皂苷對大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，探討二者配伍應(yīng)用能否對抑制腦缺血/再灌注損傷神經(jīng)元凋亡起到協(xié)同增效作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物健康♂Wistar大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量(270±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 藥品與試劑依達(dá)拉奉注射液(Edaravone Injection，EDA)，購自南京先聲東元制藥有限公司，規(guī)格5 mL/10 mg，批號：80-170510；丹參多酚酸(Salvia nolic acids, SAL)，購自天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，批號：20180901；三七總皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)，購自廣西梧州制藥股份有限公司，批號：18080416；Bcl-2(ab196495)、Bax(ab199677)、cleaved caspase-3(ab49822)、NeuN(ab177487)、β-actin(ab179467)抗體，購自英國Abcam公司；PI3K(17366)、p-AKT(4060)、AKT(4685)抗體，購自美國CST公司。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1088)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器激光散斑血流儀(英國moor公司)；IX73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Western Blot電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Trans-Blot轉(zhuǎn)膜儀(美國Invitrogen公司)；Amersham imager 600超靈敏多功能成像儀(美國General Electric公司)。

1.4 大鼠腦缺血/再灌注損傷模型的建立采用改良線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)，方法如下：將大鼠吸入異氟烷麻醉后，仰臥固定于37 ℃恒溫床，使用激光多普勒血流儀監(jiān)測腦血流；將頸部正中備皮消毒，縱向切開，鈍性分離頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA，暫時(shí)夾閉CCA及ICA，顯微剪于ECA近心端做V形切口，將硅膠包被的尼龍線栓插入V形切口，緩慢推進(jìn)，直至插入大腦中動(dòng)脈，輕遇阻力即停止，觀察激光多普勒監(jiān)測腦血流急驟下降。栓塞1.5 h后將線栓拔出再灌，激光多普勒監(jiān)測腦血流恢復(fù)。假手術(shù)組不進(jìn)行插線栓操作，其余步驟同模型組。參考Longa的5級 4 分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，評分≥2分的大鼠為模型制備成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組與給藥將Wistar大鼠隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組(Sham)、腦缺血/再灌注組(I/R)、依達(dá)拉奉組(EDA，6 mg·kg-1)、丹參多酚酸組(SAL，21 mg·kg-1)、三七總皂苷組(PNS，100 mg·kg-1)、丹參多酚酸配伍三七總皂苷組(SAL+PNS，21 mg·kg-1+100 mg·kg-1)。尾靜脈注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥3 d，Sham組及I/R組給予相同容積生理鹽水。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)評分取材前對大鼠進(jìn)行mNSS神經(jīng)功能評分[12]，觀察各組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況，評分內(nèi)容主要包括運(yùn)動(dòng)測試、感覺測試、平衡測試、反射測試和異常運(yùn)動(dòng)5個(gè)方面，總分18分，神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重，得分越高。

1.7 局部腦血流檢測將大鼠吸入異氟烷麻醉后，置于37 ℃保溫床上，切開頭部正中皮膚，刮除顱骨骨膜，將前囟暴露。通過激光散斑腦血流儀New single image功能掃描并保存腦血流圖像；通過moor LDI Laser Doppler Imager Review V60軟件對圖像進(jìn)行血流分析，采用Graphpad Prism5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。

1.8 HE染色及Nissl染色將大鼠吸入異氟烷麻醉后，仰臥開胸，經(jīng)心尖灌流生理鹽水，再緩慢灌注4%多聚甲醛。將大鼠斷頭取腦，腦組織用4%多聚甲醛溶液固定過夜，然后將腦組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟及包埋，做厚度5 μm的冠狀切片。將石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后分別進(jìn)行常規(guī)HE染色及Nissl染色，Olympus顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.9 TUNEL與NeuN免疫熒光雙染檢測缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡取大鼠腦組織，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后，蔗糖溶液梯度脫水，將腦組織通過OCT包埋后做連續(xù)冠狀冰凍切片，厚度20 μm，進(jìn)行TUNEL與NeuN熒光雙染，具體步驟如下：① 將冰凍切片用含0.5% Tirton X-100的PBS溶液通透30 min；② 將冰凍切片置于煮沸的檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行抗原修復(fù)；③ 滴加正常山羊血清工作液覆蓋組織，室溫封閉30 min；④ 滴加NeuN(1 ∶400)一抗，4 ℃孵育過夜；⑤ 次日滴加TRITC 標(biāo)記的熒光二抗(1 ∶200)及TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min；⑥滴加DAPI溶液染核，并用PBS溶液清洗3遍后，滴加抗熒光淬滅劑封片；⑦使用Olympus倒置熒光顯微鏡觀察缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡情況，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率/%=凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量 ×100%。

1.10 免疫熒光法檢測缺血半暗帶cleaved caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)取大鼠腦冰凍切片，用含0.5% Tirton X-100的PBS溶液通透30 min后，置于煮沸的檸檬酸鈉溶液中抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉30 min；在切片上滴加一抗，即兔抗cleaved caspase-3(1 ∶200)抗體，放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；次日于37 ℃下避光孵育FITC標(biāo)記的熒光二抗(1 ∶500)；使用DAPI溶液染核后，滴加抗熒光淬滅封片劑；使用Olympus倒置熒光顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野拍照，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)。

1.11 Western blot法檢測缺血半暗帶Bcl-2/Bax PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)提取各組大鼠腦缺血半暗帶總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日孵育HRP標(biāo)記的二抗1 h后，加入顯影液。用超靈敏多功能成像儀曝光目的條帶，采用ImageJ軟件分析各目的蛋白/β-actin的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠局部腦血流變化通過激光散斑血流儀檢測大鼠局部腦血流情況，如Fig 1所示，缺血/再灌注3 d以后，與Sham組比較，I/R組腦血流明顯下降(P<0.01)；與I/R組比較，EDA組、SAL組、PNS組、SAL+PNS組腦血流明顯增加(P<0.05，P<0.01)；SAL+PNS組腦血流改善情況優(yōu)于SAL組、PNS組(P<0.05)。

Fig 1 Regional cerebral blood flow in different group of n=10)##P<0.01 vs Sham; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R; △P<0.05 vs SAL or PNS

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分情況如Fig 2所示，I/R組較Sham組mNSS評分明顯升高，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，差異具有顯著性(P<0.01)；與I/R組相比，EDA組、SAL組、PNS組、SAL+PNS組mNSS評分明顯下降(P<0.01)，且SAL+PNS組mNSS評分低于SAL組、PNS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，神經(jīng)功能缺損得到改善。

Fig 2 mNSS score of different groups of n=10)##P<0.01 vs Sham; **P<0.01 vs I/R; △P<0.05 vs SAL or PNS

2.3 各組大鼠缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示(Fig 3)，Sham 組大腦皮層組織形態(tài)正常，細(xì)胞核清晰，染色均勻，細(xì)胞間隙致密；I/R組細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞間隙疏松；與I/R組比較，EDA組、SAL組、PNS組、SAL+PNS組形態(tài)學(xué)明顯改善，正常細(xì)胞數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)較為完整，細(xì)胞核較為清晰，且SAL+PNS組形態(tài)學(xué)改善情況優(yōu)于SAL組、PNS組。

Fig 3 HE staining image of different groups of rats(×400)

2.4 各組大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元損傷情況Nissl染色顯示(Fig 4)，Sham 組神經(jīng)元形態(tài)正常，排列規(guī)整，Nissl體數(shù)目豐富，著色均勻；I/R組神經(jīng)元形態(tài)異常，呈空泡樣變化，排列紊亂，核膜模糊不清，Nissl體數(shù)目減少(P<0.01)；與I/R組相比，EDA組、SAL組、PNS組、SAL+PNS組神經(jīng)元形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，染色較均勻，Nissl體數(shù)目增多，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，且SAL+PNS組Nissl體數(shù)目多于SAL組、PNS組(P<0.05)。

Fig 4 Nissl staining image of different groups of rats(×400). n=5)##P<0.01 vs Sham; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R; △P<0.05 vs SAL or PNS

2.5 各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況TUNEL與NeuN熒光雙染顯示(Fig 5)，Sham組大腦皮層幾乎無凋亡細(xì)胞；I/R組TUNEL/NeuN陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增多，神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重(P<0.01)；與I/R組相比，SAL組、PNS組、SAL+PNS組 TUNEL/NeuN陽性細(xì)胞及神經(jīng)元凋亡率減低(P<0.05，P<0.01)，且SAL+PNS組神經(jīng)元凋亡率低于SAL組、PNS組(P<0.05)。

Fig 5 Neuron apoptosis in different groups ##P<0.01 vs Sham; *P<0.05,**P<0.01 vs I/R; △P<0.05 vs SAL or PNS

2.6 各組大鼠Bcl-2/Bax表達(dá)的變化如Fig 6所示，與Sham組比較，I/R組大鼠腦缺血半暗帶Bcl-2/Bax相對蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與I/R組比較，SAL組、PNS組Bcl-2/Bax表達(dá)升高(P<0.05)，SAL+PNS組Bcl-2/Bax表達(dá)顯著升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SAL+PNS組Bcl-2/Bax表達(dá)顯著高于SAL組、PNS組(P<0.01)。

Fig 6 Relative expression of Bcl-2/Bax in different group of rats n=3)##P<0.01 vs Sham; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R; △△P<0.01 vs SAL or PNS

2.7 各組大鼠cleaved caspase-3表達(dá)的變化如Fig 7所示，與Sham組比較，I/R組cleaved caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01)；與I/R組相比，SAL組、PNS組cleaved caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，SAL+PNS組cleaved caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)；SAL+PNS組下降程度優(yōu)于SAL組、PNS組(P<0.01)。

Fig 7 The positive expression of cleaved caspase-3 in different group of rats(×400). n=5)##P<0.01 vs Sham; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R; △△P<0.01 vs SAL or PNS

2.8 對各組大鼠PI3K/AKT信號通路的影響如Fig 8所示，與I/R組比較，SAL組、PNS組大鼠腦缺血半暗帶PI3K蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，p-AKT/AKT蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；SAL+PNS組PI3K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)量均升高(P<0.01)，且SAL+PNS組升高程度優(yōu)于SAL組及PNS組(P<0.05，P<0.01)。

Fig 8 The protein expression of PI3K/AKT signaling pathway in different groups of n=3)##P<0.01 vs Sham; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R; △P<0.05, △△P<0.01 vs SAL or PNS

3 討論

腦中風(fēng)目前已成為致死率僅次于缺血性心臟病的第二大致死性疾病，且以缺血性腦中風(fēng)為主。腦缺血后可引發(fā)一系列病理反應(yīng)[13]，其中細(xì)胞凋亡是腦缺血/再灌注損傷過程中神經(jīng)元重要的死亡形式。當(dāng)腦缺血/再灌注發(fā)生后，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞色素C(cytochrome-C，Cyt-c)釋放，促進(jìn)凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)發(fā)生同源寡聚化，促進(jìn)caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，被激活的caspase-9繼而激活其他caspase，如caspase-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2家族，共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是細(xì)胞凋亡抑制因子，可阻止Cyt-c的釋放，并促進(jìn)細(xì)胞核谷胱甘肽(L-glutathione, GSH)的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，降低caspase的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。Bax不僅可與Bcl-2形成二聚體，進(jìn)而拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用，還能增加線粒體的通透性，促進(jìn)Cyt-c的釋放，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。大腦局灶性缺血后，缺血中心區(qū)將發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)損傷，而缺血半暗帶依靠其殘余血流量及新生小血管提供的能量可使細(xì)胞保持一段時(shí)間的活力，血腦屏障仍保持相對完整，故其細(xì)胞凋亡在一定程度上是可逆的，因此通過抑制缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能是減輕腦缺血/再灌注損傷一個(gè)重要思路。

中醫(yī)理論認(rèn)為，腦中風(fēng)的主要病理因素為風(fēng)、火、痰、氣、瘀，而氣虛血瘀是其重要病機(jī)之一。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、毒副作用小、療效穩(wěn)定等優(yōu)勢，在抗腦缺血治療中越來越受到人們的重視。丹參最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀的功效，三七具有活血化瘀、補(bǔ)虛強(qiáng)壯之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[14]，丹參、三七有效組分配伍可通過抑制腫瘤壞死因子-α、白介素-1β、白介素-6的釋放，調(diào)節(jié)腦缺血/再灌注后炎癥反應(yīng)；通過調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、丙二醛的表達(dá)而降低缺血/再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)；并可通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長因子的釋放，發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過應(yīng)用丹參多酚酸、三七總皂苷及其配伍干預(yù)大鼠腦缺血/再灌注損傷，可顯著提高大鼠缺血側(cè)腦血流，改善缺血半暗帶神經(jīng)元組織形態(tài)學(xué)變化，降低神經(jīng)元凋亡率，上調(diào)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)，降低cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，激活PI3K/AKT信號通路，且配伍應(yīng)用治療效果明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，對各項(xiàng)指標(biāo)均有明顯的改善。丹參多酚酸及三七總皂苷的腦保護(hù)作用機(jī)制可能與通過激活PI3K/AKT信號通路抑制神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。為進(jìn)一步揭示丹參多酚酸及三七總皂苷配伍對腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，本課題組將繼續(xù)深入研究其相關(guān)治療機(jī)制。