齊瑞芳，包素雅，邵 國

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，包頭醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

自噬是一個進化上保守的細胞過程，它可以通過溶酶體的降解來回收細胞成分[1-2]。它是維持應(yīng)激狀態(tài)下細胞存活所必需的新陳代謝的必要過程，包括饑餓、低氧等[3]。自噬的激活與否與腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心血管疾病、代謝性疾病、衰老、發(fā)育等息息相關(guān)，適度的自噬被認為是有益的。據(jù)報道自噬對大鼠大腦的各種損傷起保護作用[4]。 研究報道顯示，自噬的上調(diào)可以保護神經(jīng)元免受缺血性損傷[5]。自噬誘導(dǎo)劑可在鼠模型中保護神經(jīng)元免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞死亡[6]。甲基化抑制劑5-雜氮脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)可以誘導(dǎo)慢性粒細胞K-562 和MEG-01細胞自噬[7-8]。5-Aza-CdR能否在神經(jīng)細胞中通過誘導(dǎo)自噬作用進行治療與其相關(guān)的疾病的還需要進一步驗證。

哺乳動物雷帕雷素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路在自噬的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(tuberous sclerosis complex，TSC)是由TSC1(又稱為hamartin)和TCS2(又稱tuberin)形成異二聚體，其可以通過TSC2的小GTP酶激活蛋白(GTPase-activating protein，GAP)結(jié)構(gòu)域而負調(diào)控mTOR信號傳導(dǎo)[9]。本研究中，通過確定5-Aza-CdR能否對小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22細胞產(chǎn)生自噬，可否通過TSC1/mTOR通路進行研究，從而為5-Aza-CdR能否作為自噬誘導(dǎo)劑提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株HT22細胞購自北京協(xié)和細胞庫。

1.2 試劑DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、抗生素(青霉素、鏈霉素等)購自美國Sigma公司；兔抗TSC1多克隆抗體(#4906)、mTOR(#2983)，p-mTOR(Ser2448)(#5536)，LC3A/B(#4108)購自美國CST公司，5-Aza-CdR(HL-151026)購自西安匯林生物科技有限公司，RIPA裂解液(P0013K)購自杭州碧云天生物技術(shù)公司，辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(ZB2305)，Alexa FluorTM594山羊抗兔IgG(A32740)和DAPI(S36939)購自美國Invitrogen公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京普利來基因技術(shù)有限公司。

1.3 儀器NanoDrop 2000紫外分光光度計、Multiskan FC型全自動酶標儀購自美國Thermo Fisher公司，熒光定量PCR儀7900HT購自美國ABI公司，垂直電泳槽、蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司，化學(xué)發(fā)光儀天能5800購自上海天能科技有限公司，Nikon A1實時全光譜激光共聚焦顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.4 細胞培養(yǎng)和分組小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃，5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)，將細胞分為對照組和5-Aza-CdR組。

1.5 5-Aza-CdR處理細胞5-Aza-CdR粉末使用DMSO溶解，制成濃度為100 mmol·L-1的母液。使用時用PBS或培養(yǎng)基稀釋5-Aza-CdR為濃度1 mmol·L-1，在長至0.6～0.7的HT22細胞中，與誘導(dǎo)劑一起加至培養(yǎng)基中，使其終濃度為1、5、10 μmol·L-1。培養(yǎng)24 h后常規(guī)收集細胞，樣品凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTS檢測細胞活力選取生長狀態(tài)良好的HT22細胞，將其種于96孔板中，每孔1×103個細胞，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。24 h后，加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化TH22細胞，每個分組重復(fù)6個復(fù)孔,設(shè)立一個空白孔，只加入100 μL的完全培養(yǎng)基，作為空白對照。培養(yǎng)24 h后取出，每孔加入20 μL的MTS，放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育150 min，取出后使用酶標儀490 nm處檢測OD值。

1.7 Real time RT-PCR將HT22細胞，待測組織凍于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r在冰上融化，每只小鼠的海馬作為一組樣品加入1 mL TRIzol常規(guī)提取各組RNA，測定RNA濃度。每組樣品各取1 μg，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。從每組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中各取1 μL，利用SYBR GreenⅠ試劑盒進行real time PCR 擴增，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 45 s，72 ℃30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)所得各組的CT值，利用2-ΔΔCT計算mRNA相對表達量[10]，實驗重復(fù)3次。

Tab 1 Primer sequences

1.8 Western blot將小鼠海馬分離后，待測組織凍于-80 ℃。使用時冰上融化，每只小鼠海馬樣品中加入300 μL的RIPA裂解液，加入蛋白酶抑制劑和磷酸蛋白酶抑制劑，超聲輔助裂解，BCA法測定蛋白濃度。電泳時蛋白上樣量為30 μg，條件恒流15 mA, 接著恒流400 mA轉(zhuǎn)膜過夜，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。室溫，50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，TTBS 洗膜3次，每次10 min，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TTBS 洗膜3次, 每次10 min，HRP標記的驢抗兔二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h，TTBS 洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光。

1.9 免疫組織熒光染色將24孔板每個孔中分別放入多聚賴氨酸處理的圓形蓋玻片，將HT22細胞接種于孔板中，每孔2.5×103個細胞。培養(yǎng)24 h后進行誘導(dǎo)和10 μmol·L-15-Aza-CdR處理，24 h后小心棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入40 g·L-1的多聚甲醛4 ℃固定過夜；d 2輕輕吸出多聚甲醛， PBS清洗3次，每次5 min；用2 g·L-1Triton X-100通透，室溫下孵育5 min；棄掉通透液，PBS清洗3次，每次5 min；用60 g·L-1BSA室溫封閉30 min；棄掉封閉液，用PBS清洗3次，每次5 min；用10 g·L-1BSA 1 ∶300稀釋一抗，4 ℃孵育過夜；次日取出孔板，復(fù)溫孵育1 h后用BSA-PBS洗滌3次。加入熒光二抗避光室溫孵育4 h；用BSA-PBS洗滌2次，再用去離子水洗1次，浸泡在去離子水中；取出蓋玻片將有細胞的一面反過來小心扣在滴加DAPI的載玻片上，用指甲油封片。-20 ℃保存，盡快使用激光共聚焦進行掃描和分析熒光強度。

1.10 質(zhì)粒構(gòu)建和DNA轉(zhuǎn)染TSC1-pcDNA3質(zhì)粒由Nellist博士友情提供[11]。然后，將TSC1亞克隆到EGFP載體中。使用NeroTMTransfection進行TSC1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT22細胞，使TSC1過表達，將細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中。轉(zhuǎn)染后，將細胞孵育48 h，然后收集。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR降低HT22細胞的活力用0(作為對照)，1、5或10 μmol·L-1,5-Aza-CdR處理HT22細胞。結(jié)果顯示，10 μmol·L-1的5-Aza-CdR與對照組相比，可以明顯降低HT22細胞的活力(P<0.01，見Fig 1)。

Fig 1 Effect of 5-Aza-CdR on cell vitality **P<0.01 vs control

2.2 5-Aza-CdR促進TSC1 mRNA的表達Real time RT-PCR的結(jié)果顯示10 μmol·L-1的5-Aza-CR顯著增加了TSC1 mRNA(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而mTOR和LC3 mRNA在這些濃度下，均未產(chǎn)生任何明顯變化(Fig 2)。結(jié)果提示5-Aza-CdR在mRNA水平上對TSC1可產(chǎn)生影響，而對mTOR和LC3 mRNA的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 2 Expression of TSC1, mTOR, LC3 mRNA in HT22 cells **P<0.01 vs control

2.3 5-Aza-CdR可增加TSC1蛋白的表達，降低p-mTOR的表達，增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例根據(jù)Westren blot的結(jié)果顯示，10 μmol·L-15-Aza-CdR可增加TSC1蛋白(P<0.01),具有統(tǒng)計學(xué)意義；mTOR蛋白表達則不受5-Aza-CdR的影響，而p-mTOR的表達降低(P<0.01)。但是在用5 μmol·L-15-Aza-CdR(P<0.05)和10 μmol·L-1(P<0.01)處理的樣品中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加了(Fig 3)。結(jié)果提示5-Aza-CdR可以促進HT22細胞的自噬，并且TSC1/mTOR通路參與其中。

2.4 5-Aza-CdR增強小鼠海馬中TSC1蛋白的熒光強度為了進一步檢測5-Aza-CdR在形態(tài)學(xué)對TSC1蛋白的影響，本研究選取有效濃度10 μmol·L-1進行細胞免疫熒光染色，檢測TSC1表達水平及其定位(Fig 4)。結(jié)果顯示，5-Aza-CdR組相比對照組TSC1的熒光強度增強，其表達主要集中在細胞漿中，從形態(tài)學(xué)上進一步證明5-Aza-CdR促進TSC1蛋白的表達，結(jié)果與Western blot一致。

Fig 3 Protein expression of TSC1, mTOR, p-mTOR, LC3 in HT22 cells exposed to 5-Aza-CdR n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs control

Fig 4 Immunofluorescence of TSC1 protein in HT22 cells exposed to 5-Aza-CdR(Bar=50 μm)

2.5 過表達TSC1抑制p-mTOR,促進LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加為了進一步證明TSC1在此過程中起關(guān)鍵性作用，本研究進行TSC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，使其過表達，發(fā)現(xiàn)TSC1過表達后，mTOR和p-mTOR蛋白表達降低(P<0.05), LC3-Ⅱ的表達增加(Fig 5)。

Fig 5 Effect of TSC1 over-expression on protein expression of mTOR, p-mTOR and LC3 in HT22 cells n=6)*P<0.05, **P<0.01 vs control

3 討論

在本研究中，通過體外培養(yǎng)小鼠海馬神經(jīng)細胞HT22檢測自噬標記物L(fēng)C3作為自噬的標記物，通過LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例衡量細胞自噬水平。本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR可通過誘導(dǎo)自噬增加，在此過程中有TSC1/mTOR通路的參與其中。有研究報道5-Aza-CdR可以誘導(dǎo)人慢性粒細胞自噬[7-8]。因此，推測5-Aza-CdR有可能作為自噬誘導(dǎo)劑而在疾病中發(fā)揮作用?？紤]到自噬在腦外傷、腦缺血、衰老等過程中起著重要作用[2,12]，探討5-Aza-CdR對神經(jīng)元細胞自噬的作用可能具有一定的意義。

為了進一步研究5-Aza-CdR對神經(jīng)細胞的作用機制。本研究觀察了其對TSC1/mTOR通路的研究。TOR是自噬的主要調(diào)節(jié)機制之一，那么5-Aza-CdR是否通過此通路發(fā)揮作用，鮮有報道。 mTOR是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinases, PI3K)相關(guān)激酶家族的成員，是細胞生長，細胞增殖，凋亡和自噬的重要的調(diào)節(jié)因子[13]。當(dāng)mTOR的活性降低時，將誘導(dǎo)自噬。 Kim等[14]報道，自噬增強劑訶子鞣酸通過抑制mTOR活性對神經(jīng)元細胞具有神經(jīng)保護作用。與Kim等的結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR誘導(dǎo)自噬的同時，不會改變mTOR的表達，對p-mTOR(Ser2448)的磷酸化水平被抑制的。TSC1/2在激活mTOR中起關(guān)鍵作用。TSC復(fù)合物可通過充當(dāng)GAP來負調(diào)控mTOR信號傳導(dǎo)[9]。當(dāng)誘導(dǎo)TSC1時，在鼠神經(jīng)原蟲/脊髓混合細胞(NSC-34細胞)中伴隨mTORC1失活[15]。相反，在缺失TSC1的動物模型中，mTOR信號增加了[16]。本研究中5-Aza-CdR增強了mTOR上游的TSC1表達。因此，推測5-Aza-CdR通過調(diào)節(jié)TSC1啟動子DNA甲基化狀態(tài)使TSC1增加，從而下調(diào)了mTOR活性，致自噬增加。為了證明這些分子之間的關(guān)系，本研究使TSC1在HT22細胞中過表達，結(jié)果顯示mTOR活性下調(diào)而自噬上調(diào)。

總之，本研究表明，5-Aza-CdR 增加HT22細胞自噬并且TSC1/mTOR通路參與其中，為5-Aza-CdR可能是神經(jīng)元自噬的誘導(dǎo)劑增加理論依據(jù)，但其作用的機制還需要進一步研究。