劉 琪，張巧琳，陳曉蕓，嚴(yán)尚學(xué)，吳華勛，魏 偉

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所, 抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)主要損傷關(guān)節(jié)及滑膜組織，炎癥細(xì)胞的增多、滑膜增生以及血管翳的產(chǎn)生[1]，使關(guān)節(jié)畸形失去功能[2]。病程遷延難愈[3]，RA發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚無理想的安全高效的治療方法，對(duì)其深入研究具有重要意義。在研究RA病理機(jī)制時(shí)常用大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型，其優(yōu)點(diǎn)在于建模方法簡單，發(fā)病較為迅速。此外大鼠AA在關(guān)節(jié)腫脹及淋巴細(xì)胞浸潤等方面的表現(xiàn)與RA患者相似[4]，為研究RA提供了合適的動(dòng)物模型。對(duì)RA進(jìn)行研究時(shí)，研究者傾向于研究與此相關(guān)的疾病機(jī)制與治療方法等方面，較少涉及影響成模的因素問題。

某些與自身免疫有關(guān)的疾病發(fā)生率女性通常較男性高[5]，RA的發(fā)病率也是如此，這暗示了性別因素可能影響了RA的發(fā)病過程。這可能與女性對(duì)免疫具有較高的反應(yīng)或與性別激素相關(guān)[6]。為探討性別因素在AA大鼠臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)中的差異，選用雄性和雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，在足跖皮內(nèi)注射完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA)，含卡介苗10 g·L-1誘導(dǎo)大鼠AA模型，成模后對(duì)雄性和雌性大鼠的AA成模情況(全身表現(xiàn)及病理評(píng)分)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑SD大鼠購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK(皖)2011-002。選取32只SPF級(jí)、體質(zhì)量為180 g左右的雌雄SD大鼠，于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)(安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)計(jì)劃由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)同意實(shí)施。試劑：CFA購自Chondrex inc公司。

1.2 AA模型的建立取含卡介苗10 g·L-1的CFA 100 μL，在大鼠的右后足足跖皮內(nèi)注射建立模型。正常組選擇注射100 μL的生理鹽水。

1.3 動(dòng)物分組綜合全身指標(biāo)的評(píng)分，d 15,隨機(jī)將成模大鼠分為2組(每組8只)，即雄性和雌性大鼠模型組；設(shè)立2組正常組(每組8只)即雄性和雌性大鼠正常組。共計(jì)4組。

1.4 體質(zhì)量和全身評(píng)分測(cè)定造模前(d 0)及造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)稱量體質(zhì)量。觀察全身表現(xiàn)，進(jìn)行全身評(píng)分[7]。

1.5 大鼠足爪腫脹度測(cè)定非致炎側(cè)(左后足)足爪容積在造模前(d 0)與造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)測(cè)定，求出繼發(fā)側(cè)(左后足)的足爪腫脹度[8]。

1.6 大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和炎癥指數(shù)評(píng)分觀察造模后(d 7、d 14、d 18、d 21、d 24、d 28)大鼠發(fā)生的病變狀況，記錄關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和炎癥指數(shù)評(píng)分[7]。

1.7 病理學(xué)觀察d 28大鼠全部處死，對(duì)其踝關(guān)節(jié)和脾臟進(jìn)行病理評(píng)價(jià)[9]。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建雄性和雌性大鼠AA模型大鼠在產(chǎn)生炎癥后的18 h，右后足爪出現(xiàn)腫脹高峰，3 d后炎癥反應(yīng)下降，d 9后再次發(fā)生腫脹；繼發(fā)病變?cè)谥卵缀骴 14出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象；d 21左右，前后肢腫脹(Fig 1A-C)，尾根部及鼻翼附近產(chǎn)生結(jié)節(jié)(Fig 1D-E)；在成模過程中，雄性和雌性大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、精力頹靡和活動(dòng)受阻等，提示造模成功。

Fig 1 Secondary inflammation of rat AA(n=8)

2.2 雄性和雌性大鼠體質(zhì)量的變化情況從d 14開始，模型組大鼠體質(zhì)量隨炎癥的嚴(yán)重程度下降。模型組大鼠的體質(zhì)量因炎癥的產(chǎn)生明顯低于正常組同性別的大鼠，d 21后處于平穩(wěn)狀態(tài)。對(duì)模型組雄性和雌性大鼠的體質(zhì)量比較發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠的體質(zhì)量明顯下降(Fig 2)。

Fig 2 Changes in body weight of male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.3 雄性和雌性大鼠足爪的腫脹狀況正常組和同性別模型組大鼠的足爪腫脹度比較結(jié)果顯示，d 14開始，模型大鼠足爪腫脹度明顯升高(Fig 3)，模型組雄性和雌性大鼠之間差異并未有顯著性。

Fig 3 Changes of paw swelling in male *P<0.05,**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats

2.4 雄性與雌性AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和全身評(píng)分的變化情況雄性、雌性模型組d 7開始關(guān)節(jié)腫脹數(shù)均明顯升高，d 21左右達(dá)高峰，d 24后關(guān)節(jié)腫脹數(shù)、關(guān)節(jié)炎指數(shù)與全身評(píng)分逐漸下降，雄性和雌性大鼠評(píng)分差異均無顯著性(Fig 4)。

Fig 4 Changes of joint swelling, arthritis index and systemic score in male and female AA rats A:Effect on joint swelling; B:Effect on arthritis index;C:Effect on arthritis global assessment

2.5 雄性和雌性大鼠踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分變化情況病理切片顯示，在大鼠AA模型中關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生，有血管翳以及炎癥細(xì)胞大量浸潤(Fig 5A-D)。對(duì)踝關(guān)節(jié)進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn)：模型組中雄性和雌性大鼠的滑膜細(xì)胞增殖情況變多，在骨侵蝕、炎癥細(xì)胞浸潤、血管翳及炎癥的嚴(yán)重程度較正常組嚴(yán)重且差異有顯著性(Fig 6A-E)。在對(duì)模型組雄性和雌性大鼠之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在骨質(zhì)侵蝕與炎癥方面雄性和雌性大鼠之間差異有顯著性且雌性大鼠的嚴(yán)重程度高于雄性大鼠(Fig 6B,E)。

Fig 5 Pathomicrographs of ankle joints in rats A: Normal male rats (♂); B: Female normal rats (♀); C: Male model rats (♂); D: Female model rats (♀).Arrow a: Synoviocytes hyperplasia; arrow b: Inflammatory cell infiltration; arrow c: Bone erosion

Fig 6 Changes of ankle joint pathological scores in male and female rats n=8)A: Synoviocytes hyperplasia; B: Bone erosion; C: Cell infiltration; D: Pannus; E: inflammation.**P<0.01 rats in normal group vs rats of the same gender model group;#P<0.05,##P<0.01 male model group rats vs female model group rats

2.6 雄性和雌性大鼠脾臟病理評(píng)分變化情況病理切片結(jié)果顯示，在大鼠AA模型中藍(lán)染的淋巴細(xì)胞聚集范圍擴(kuò)大(Fig 7A-D)。對(duì)脾臟進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的淋巴結(jié)出現(xiàn)增生現(xiàn)象，生發(fā)中心的數(shù)量變多且與正常組大鼠差異有顯著性(FIG 8A,C,E)。模型組中雄雌進(jìn)行比較的結(jié)果顯示，雄性和雌性大鼠的動(dòng)脈周圍淋巴鞘細(xì)胞的密度、邊緣區(qū)增生與生發(fā)中心數(shù)量差異有顯著性，雌性大鼠的炎癥程度較雄性大鼠嚴(yán)重(Fig 8A,C,E)。

Fig 7 Micrographs of spleen in rats n=8)A: Male normal group rats (♂); B: Female normal group rats (♀); C: Male model group rats (♂); D: Female model group rats (♀).Arrow a: Germinal center, arrow b: Marginal zone hyperplasia; arrow c: Red pulp hyperplasia; arrow d: Periarterial lymph sheath

Fig 8 Changes in spleen pathological scores in male and female n=8)A: Periarterial lymphatic sheath; B: Lymph node hyperplasia; C: Marginal zone hyperplasia; D: Red pulp hyperplasia; E: Germinal center.**P<0.01 normal group rats vs same-sex model group rats;#P<0.05,##P<0.01 male rats in model group vs female rats in model group

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、生活方式等多因素有關(guān)。

研究疾病的機(jī)制需選用合適的動(dòng)物模型，可模擬條件顯示出與人類疾病相似的狀態(tài)。大鼠AA模型與RA患者的疾病特征類似且具有發(fā)病快、模型制備方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，常作為研究RA病因或治療手段等的重要工具[10]。在RA疾病中存在性別差異，可能是女性對(duì)體液免疫有較強(qiáng)的反應(yīng)與性激素共同影響的結(jié)果[6]，雌激素可雙向影響細(xì)胞免疫，當(dāng)體內(nèi)雌激素含量升高時(shí)(分娩前)患有RA的患者疾病癥狀減輕，當(dāng)含量降低時(shí)(分娩后)，又呈現(xiàn)出原有的疾病癥狀[11]。細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)對(duì)RA的發(fā)病有一定的影響[12-13]。

為探討在動(dòng)物模型中是否因雌雄差異而引起疾病嚴(yán)重程度的不同，采用雌雄年齡、體質(zhì)量相近的SD大鼠，經(jīng)10 g·L-1的CFA誘導(dǎo)后構(gòu)建AA模型，大鼠在產(chǎn)生炎癥后的18 h，足爪出現(xiàn)腫脹高峰，d 9左右再次發(fā)生腫脹；繼發(fā)病變?cè)谥卵缀骴 14左右出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象；d 21左右達(dá)炎癥高峰，炎癥發(fā)生較為迅速；模型組雌性大鼠的體質(zhì)量較雄性大鼠輕，可能與雌性大鼠對(duì)炎癥的反應(yīng)強(qiáng)烈，食欲減退，抵抗力下降有關(guān)；在對(duì)關(guān)節(jié)與脾臟的一系列評(píng)分發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠的炎癥嚴(yán)重程度較雄性大鼠深，且差異有顯著性，與RA女性患者發(fā)病率較男性高的研究結(jié)果相吻合。本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的大鼠AA模型，雌性與雄性大鼠的疾病嚴(yán)重程度在臨床表現(xiàn)與病理方面存在差異，雌性大鼠更易于誘導(dǎo)模型。然而在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，研究者采用雄性大鼠，可能與排除性激素的干擾及雌性大鼠抵抗力低，死亡率較雄性大鼠高有關(guān)。期望本文能對(duì)研究RA雄性與雌性的大鼠選擇提供新的參考依據(jù)，從而更加全面地研究RA。