吳沁航，鮑 剛，朱麗文，潘 揚

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

乳腺癌是源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，在中年女性中具有較高的發(fā)病率和死亡率，是世界范圍內(nèi)危害女性身心健康最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前常用的治療方法主要包括外科手術、放化療和分子靶向治療等[2-3]。盡管早期診斷、早期治療使乳腺癌的治療效果明顯提高，然而乳腺癌術后復發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者的主要死因，尤其是針對三陰性乳腺癌的治療尚缺乏有效的手段[4-5]。篩選中藥抗腫瘤的活性成分已成為開發(fā)腫瘤治療藥物的有效途徑之一。藍萼甲素( glaucocalyxin A，GLA) 是藍萼香茶菜Raddosiaamethytoieds(Benth) Ham的主要活性成分，為15-氧-16 貝殼杉烯骨架結(jié)構的二萜類化合物，具有抗腫瘤、耐缺氧等多種藥理活性，但其作用靶點和機制尚不明確[6-7]。本實驗旨在研究GLA對三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231的誘導凋亡活性及其可能的作用機制，為進一步開發(fā)天然產(chǎn)物有效成分治療三陰性乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑藍萼甲素(純度98.58%，批號：DST180702-075)購自成都德思特生物技術有限公司；人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s、人正常乳腺上皮細胞株MCF-10a均購自美國ATCC公司(批號：ATCC?HTB-26、ATCC?HTB-129、ATCC?CRL-10317)；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素溶液購自美國HyClone公司(批號：AAF202144、1665845、SV30010)；胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：8108787)；二甲基亞砜(DMSO)、MTT購自美國Sigma公司(批號：SHBH2446V、SP1080)；細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司(批號：7235944)；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海生工有限公司(批號：8511311、B300537)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗體購自美國CST公司(批號：5174、4257、4288、9611、4691)；Bcl-2、Bcl-xl、Bax抗體購自英國Abcam公司(批號：Ab59348、Ab45002、Ab32503)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL檢測試劑盒購自上海生工有限公司(批號：C525DA 0003、D412DA0006)。

1.2 儀器DMI3000B倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Cellometer Auto T4 細胞計數(shù)儀(美國Nexcelom公司)；SPARK 10M多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；HEPAcell 150i型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；PowerPacTMHC電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-Rad 公司)；NIM2045凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Light Cycler96熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；VS-1300L-V超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MDA-MB-435s，乳腺正常上皮細胞株MCF-10a培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定細胞的增殖活性取對數(shù)生長期的MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-10a細胞，PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)后以1×104個每孔接種于96孔板，細胞貼壁后分別加入100 μL濃度為0、1、2、4、8、12、20 μmol·L-1的GLA作用細胞48 h，每個濃度設5個復孔，每孔加入MTT 20 μL(5 g·L-1)，37 ℃孵育4 h后棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩15min使甲瓚充分溶解，酶標儀570 nm處測定其光吸收值(A)，計算細胞存活率/%=(A給藥組/A對照組)×100%，并計算半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration, IC50)。

2.3 細胞形態(tài)觀察取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)以5×104個每孔接種于6孔板，細胞貼壁后分別加入終濃度為0、2、4、8 μmol·L-1的藍萼甲素，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，拍照保存。

2.4 Annexin V/PI雙標記法檢測MDA-MB-231細胞凋亡取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，以5×106個每孔接種于6孔板，貼壁后加入0、2、4、8 μmol·L-1的藍萼甲素培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞48 h，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，Binding buffer重懸細胞并調(diào)整細胞濃度為1×109個·L-1，取細胞懸液100 μL，加入FITC標記的Annexin V和PI各5 μL，冰上避光反應15 min，流式細胞儀檢測。

2.5 qRT-PCR檢測MDA-MB-231細胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bax mRNA表達取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，5×106個每孔接種于培養(yǎng)皿，細胞貼壁后加入0、2、4、8 μmol·L-1的藍萼甲素作用細胞48 h，提取細胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，實時熒光定量PCR對各基因進行擴增，引物序列：Bcl-2上游引物5′-GCG GCCTCTGTTTGATTTCT-3′，下游引物5′-TCACTTGT GGCCCAGATAGG-3′；Bcl-xl上游引物5′-CGTGG AAAGCGTAGACAAGG-3′，下游引物5′-GCTGCATT GTTCCCGTAGAG-3′；Bax上游引物5′-ACCATCTTT GTGGCTGGAGT-3′，下游引物5′-AAGACACAGTCC AAGGCAGT-3′；β-actin上游引物5′-ACTCTTCCA GCCTTCCTTCC-3′，下游引物5′-CAATGCCAGGGTA CATGGTG-3′，各基因相對表達量用2-ΔΔCt表示。

2.6 Westernblot檢測蛋白表達變化MDA-MB-231細胞制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后以5×106個每孔接種于培養(yǎng)皿，不同濃度(0、2、4、8 μmol·L-1)藍萼甲素分別作用細胞48 h，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，PBS漂洗3次，細胞蛋白提取試劑盒提取細胞全蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)樣品濃度，每孔上樣蛋白80 μg經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別孵育Bcl-2、Bcl-xl、Bax、p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt抗體結(jié)合膜上蛋白，4 ℃孵育過夜，PBST洗膜15 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜15 min×3次，ECL發(fā)光試劑盒曝光顯影。

2.7 統(tǒng)計學方法實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 藍萼甲素對乳腺癌細胞的增殖抑制作用不同濃度的GLA分別作用于細胞MDA-MB-231、MDA-MB-435s、MCF-10a，培養(yǎng)48 h后，3種細胞均受到不同程度的增殖抑制作用。見Tab 1，GLA對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的抑制活性強于MDA-MB-435s細胞，對正常乳腺上皮細胞MCF-10a的增殖抑制活性較低，GLA對MDA-MB-231、MDA-MB-435s細胞48 h的IC50分別為5.11、6.32 μmol·L-1。

Tab 1 Effects of GLA on MDA-MB-231,MDA-MB-435s and MCF-10a cell

3.2 藍萼甲素對MDA-MB-231細胞生長形態(tài)的影響不同濃度的GLA作用于MDA-MB-231細胞48 h后，倒置顯微鏡觀察顯示，對照組細胞呈長梭狀貼壁生長，細胞間連接緊密，未見變形細胞，隨著GLA濃度增大，MDA-MB-231細胞貼壁密度逐漸減小，細胞間隙增大，并且細胞形態(tài)變圓，細胞皺縮并脫落，見Fig 1。

Fig 1 Effects of GLA on MDA-MB-231 cell morphology(×200)

3.3 藍萼甲素對MDA-MB-231細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測GLA誘導MDA-MB-231細胞凋亡。結(jié)果顯示，對照組細胞總凋亡率為2.46%，隨著GLA濃度增加，MDA-MB-231細胞凋亡率明顯升高，2、4、8 μmol·L-1的GLA作用后，細胞總凋亡率分別為15.65%、35.56%、61.65%，與對照組相比差異有顯著性，見Fig 2。

Fig 2 Effects of GLA on MDA-MB-231 cell A:GLA induced apoptosis in MDA-MB-231 cells by flow cytometry; B: Histogram of apoptotic cell rates.*P<0.05 vs control

3.4 藍萼甲素對MDA-MB-231細胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bax mRNA表達的影響qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，不同濃度GLA作用MDA-MB-231細胞48 h后，與對照組相比，隨著GLA濃度增加，Bcl-2和Bcl-xl mRNA的相對表達量明顯下降，Bax mRNA的相對表達量明顯升高，見Fig 3。

Fig 3 Effects of GLA on relative mRNA expression of Bcl-2, Bcl-xl and *P<0.05 vs control

3.5 藍萼甲素對MDA-MB-231細胞PI3K/Akt信號通路的影響Western blot結(jié)果顯示，MDA-MB-231細胞經(jīng)不同濃度的藍萼甲素給藥48 h后，隨著GLA濃度的增加，MDA-MB-231細胞中p-PI3K、p-Akt相對PI3K、Akt蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2及Bcl-xl蛋白相對表達量降低，Bax蛋白相對表達量升高，呈現(xiàn)GLA濃度依賴性，見Fig 4。

Fig 4 Effects of GLA on protein expression related to PI3K/Akt signaling *P<0.05 vs control

4 討論

近年來對藍萼甲素的抗腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，藍萼甲素對肝癌、肺癌、白血病、宮頸癌等均具有較強的抑制活性，其主要通過干擾細胞周期，調(diào)節(jié)機體的免疫反應抑制腫瘤的形成[8-9]。本實驗研究結(jié)果顯示，GLA可明顯抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231和MDA-MB-435s的增殖，并且隨著藥物濃度的增加，細胞間隙增大，形態(tài)發(fā)生改變。為進一步研究GLA對三陰性乳腺癌的抑制作用，本實驗通過Annexin V/PI雙染色法測定GLA對MDA-MB-231細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，GLA在0～8 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性誘導MDA-MB-231細胞凋亡。

PI3K/Akt通路是具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細胞內(nèi)信號通路，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、存活、生長等多種細胞生理功能，而這些過程又與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的聯(lián)系，因而對其信號通路傳導激活的調(diào)控是腫瘤藥理學研究的熱點之一[10]。PI3K在細胞因子等胞外信號刺激下，通過特異性催化磷脂酰肌醇第3位的羥基磷酸化，使細胞膜上的第二信使PIP3被激活，并迅速結(jié)合上其關鍵下游靶標Akt，進而磷酸化Akt第308位的蘇氨酸和第473位的絲氨酸，形成有激酶活性的磷酸化Akt(p-Akt)，活化的Akt通過調(diào)控其下游基因，如mTOR、Bcl-2、caspase 9等參與腫瘤的形成和發(fā)展。Bcl-2家族蛋白作為PI3K/Akt的下游分子，在細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著十分重要的作用，其主要通過內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)細胞凋亡[11]。Bcl-2家族的抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xl等，主要定位于細胞線粒體外膜，維持線粒體膜的穩(wěn)定性[12]。PI3K/Akt信號通過Bcl-2蛋白，引起促凋亡蛋白Bax從細胞質(zhì)向線粒體外膜移位進而發(fā)生寡聚化，使線粒體外膜上形成離子通道，破壞線粒體膜的完整性，降低線粒體膜電位，從而誘導細胞凋亡[13-14]。Western blot及qRT-PCR實驗結(jié)果顯示，GLA可劑量依賴性下調(diào)MDA-MD-231細胞中p-PI3K、p-Akt蛋白質(zhì)的表達，降低PI3K和Akt的磷酸化水平，通過抑制PI3K/Akt信號通路在mRNA及翻譯后水平同時下調(diào)MDA-MB-231細胞中Bcl-2及Bcl-xl的表達，上調(diào)Bax的表達，表明GLA可通過抑制PI3K/Akt信號通路誘導三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的凋亡。

綜上所述，GLA可明顯抑制乳腺癌細胞的增殖，通過抑制PI3K及Akt的磷酸化，使其下游靶標失活，并由內(nèi)源性途徑誘導MDA-MB-231細胞凋亡，是一種潛在的抗三陰性乳腺癌天然產(chǎn)物。