夏桂輝，賈昌俊，徐鋒，趙陽，戴朝六

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院肝膽脾外科，沈陽 110004；2.沈陽二四二醫(yī)院普通外科，沈陽 110141）

在全球惡性腫瘤患病率及死亡率的統(tǒng)計報告中，肝癌均位居前列［1-2］。2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告指出肝癌是我國癌癥致死的主因［3］。我國肝癌患者的主要致病因素為病毒性肝炎及肝硬化，多數(shù)患者早期無臨床癥狀，就診晚，預后差，且早期小肝癌不易被常規(guī)影像學檢查檢測到，因此肝癌的早期診斷是肝癌治療的重點。

《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范 （2017年版） 》［4］中提及的肝癌臨床影像學檢查方法主要有腹部超聲、CT、MRI、DSA、PET-CT和發(fā)射單光子計算機斷層。而現(xiàn)有研究［5-6］報告的關于肝癌診斷的上述影像學檢查中，對于直徑＜1 cm的微小病灶檢出率較低，易發(fā)生遺漏，導致術后短期內(nèi)即出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和復發(fā)灶，對預后造成極大的負面影響。

2009年首次報道了應用吲哚菁綠 （indocyanine green，ICG） 分子熒光成像技術在肝細胞癌切除術中探測到術前常規(guī)檢查手段難以檢測到的微小肝內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶［7-8］。不僅如此，該成像技術還具有精準度高的特點，探測發(fā)現(xiàn)的最小肝癌病灶直徑約0.15 cm［8-11］。ICG熒光成像技術是利用ICG的熒光成像特點及其在肝臟腫瘤細胞中特定的靶向滯留效應［12-13］，使用具有高度特異性的熒光探針，作用于特定的靶細胞，得到具有明暗對比度的影像，從而實現(xiàn)對肝癌病灶的精準定位。

但目前研究表明該項技術有穿透力弱［14］和假陽性率高［15-17］2點不足。假陽性病灶的檢出率及其特征仍需要臨床研究來進一步明確。故本研究擬針對這一課題進行探討。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象:收集2016年12月至2017年9月于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院肝膽脾外科行肝細胞癌肝切除手術患者的臨床資料。納入標準:（1） 術前超聲造影、增強CT和（或）增強MRI診斷為原發(fā)性肝癌，肝癌病灶距離肝臟表面均≤1 cm；（2） 術前行ICG 15分鐘潴留率 （indocyanine green 15 retention rate，ICGR15） 測定；（3） 術中用ICG分子熒光成像系統(tǒng)探測肝臟腫物顯像情況及顯像微小病灶 （微小病灶）并取材；（4） 術后病理證實肝臟腫瘤為肝細胞癌。納入患者共59例，其中，女11例，男48例。年齡35～75歲，中位年齡為58歲。乙型肝炎患者41例，丙型肝炎患者4例，脂肪肝患者1例。ICGR15值為0.8%～40.9%，中位值為5.1%。ICG注射時間為9.0～341.0 h，中位時間為74.0 h。

1.1.2 主要試劑和儀器:注射用ICG購自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責任公司 （產(chǎn)品編號:20160701），近紅外熒光成像系統(tǒng)由北京數(shù)字精準醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

應用“ICG試敏針”進行試敏檢測，確認入選對象無過敏反應。于術前1～14 d，以滅菌注射用水將ICG稀釋成5 mg/mL，將按照0.5 mg/kg體質(zhì)量計算的ICG溶液由肘靜脈注入，密切觀察患者反應，一般在10秒內(nèi)注完。測定并記錄患者ICGR15及ICG術前注射時間 （以h為單位）。肝癌切除術中，標本離體后馬上用ICG介導的免疫熒光探測儀探查已切除的離體標本，除既定切除腫物以外，有熒光反應的微小病灶予以切除，記為實驗組；同時于該離體標本上取出既定切除腫物外無熒光反應的肝組織，記為對照組。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，年齡分析采用獨立樣本t檢驗，其余因素采用非參數(shù)曼惠特尼U檢驗，分類指標采用χ2檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌病灶腫瘤表面顯影和瘤周微小病灶樣顯影病灶情況

本組59例患者腫瘤病理結果均為肝細胞癌，腫瘤直徑為0.5～20.0 cm，中位直徑為3.1 cm。顯影者50例，未顯影者9例，ICG熒光成像腫瘤表面顯影檢出率為84.74% （圖1） ；其中腫瘤剖面顯影46例 （高亮顯影33例，混雜顯影14例，環(huán)狀顯影8例），腫瘤剖面不顯影4例（圖2）。其中26例 （檢出率44.07%） 患者在熒光成像探測下新發(fā)現(xiàn)肝臟微小病灶65枚，65枚微小病灶全顯影，對照組織不顯影 （圖3）。微小病灶直徑為0.2～2.0 cm，中位直徑為0.8 cm。

2.2 微小病灶病理結果

圖1 肝癌表面熒光成像和瘤周微小病灶熒光成像Fig.1 Fluorescence imaging of the surface of a hepatocellular carcinoma and microscopic lesions around the carcinoma

圖2 肝癌剖面熒光顯影類型Fig.2 Fluorescence imaging type of the hepatocellular carcinoma profile

圖3 肝臟微小病灶熒光成像Fig.3 Fluorescence imaging of liver microlesions

65枚顯影微小肝臟病灶的病理結果為肝細胞癌4枚，非肝細胞癌61枚 （肝細胞增生20枚，肝硬化28枚，肝纖維化13枚），28枚對照組肝組織的病理結果均為非肝細胞癌 （肝硬化23枚，肝纖維化5枚）。

2.3 肝癌顯影情況差異分析

在不同顯影組中，僅腫瘤直徑這一因素存在統(tǒng)計學差異 （P＜ 0.05），見表1。腫瘤表面顯影組患者的腫瘤直徑顯著高于不顯影患者的腫瘤直徑，即肝臟腫瘤在ICG熒光顯影探測下顯像的概率與腫瘤直徑相關；腫瘤直徑越大者，越容易在ICG熒光顯影探測中顯像，見圖4。

2.4 肝癌腫瘤剖面顯影情況的差異分析

圖4 不同直徑肝癌表面顯影情況差異分析Fig.4 Variance analysis of surface imaging of liver tumors of different diameters

表1 59例肝癌患者腫瘤熒光顯影情況對比Tab.1 Contract of tumor fluorescence imaging in 59 patients with hepatocellular carcinoma

在熒光成像設備下探測，切除后的肝臟腫瘤剖面會呈現(xiàn)4種顯影狀態(tài):高亮、混合、環(huán)狀及無顯影。如表2所示，不同分化程度腫瘤的剖面顯影率存在統(tǒng)計學差異 （P＜ 0.05）。進一步分析顯示，將腫瘤分化作為自變量，剖面顯影為因變量，對其采用有序logistic回歸分析，結果顯示，分化程度與腫瘤剖面顯影顯著相關 （P＜ 0.05）。分化程度低的腫瘤剖面顯影亮度低的概率是分化高腫瘤的8.91倍，即腫瘤分化程度越高，出現(xiàn)高亮顯影的概率越高。見表3。

2.5 腫瘤旁探測出熒光顯影微小病灶的情況分析

表2 59例肝癌患者腫瘤剖面熒光顯影類型對比Tab.2 Comparison of fluorescence imaging types of hepatocellular carcinoma profile in 59 patients with hepatocellular carcinoma

表3 腫瘤剖面顯影類型及腫瘤分化的有序logistic回歸分析Tab.3 Ordered logistic regression analysis of how the fluorescence imaging type affects the hepatocellular carcinoma profile and differentiation of HCC

各項因素在探出微小病灶數(shù)目上均無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05）。即肝癌患者術中應用ICG熒光成像探測儀是否能探出顯影微小病灶，與患者年齡、性別、有無肝損傷史、有無肝硬化、ICGR15、ICG注射時間、腫瘤直徑、腫瘤為原發(fā)或復發(fā)及腫瘤分化程度等因素均不相關。見表4。

2.6 瘤周微小病灶樣顯影病灶的病理情況分析

病理結果顯示，同一患者可以探測出多個微小病灶樣顯影病灶，而且同一患者探出的多個微小病灶樣顯影病灶可以有不同的病理結果。以微小病灶樣顯影病灶而非患者為研究對象。首先以病理陽性（肝癌） 和陰性 （肝細胞增生、肝硬化、肝纖維化） 分組，進行四格表Fisher確切概率計算，結果顯示，2組在病理結果上無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05），見表5。本研究中ICG熒光成像技術診斷小肝癌的正確率為34.40 %；特異度為36.14 %；陽性預測值為6.15 %；假陽性率為68.53%；Youden指數(shù)為0.361 4。本研究微小肝癌檢出率雖然較低，但Youden指數(shù)為0.361 4，且探測出有熒光反應的65枚微小病灶中有20枚為肝細胞增生，肝細胞低度異型增生為肝臟癌前病變表現(xiàn)，說明ICG免疫熒光成像技術對檢測肝臟微小病灶及識別肝臟癌前病變有臨床價值。

表4 肝癌旁檢出熒光成像微小病灶相關因素分析Tab.4 Analysis of relevant factors for fluorescence imaging of microlesions near a hepatocellular carcinoma

2.7 實驗組假陽性情況分析

表5 肝臟微小病灶病理結果統(tǒng)計表Tab.5 Overview of the pathological results of liver microlesions

根據(jù)計算結果得知微小病灶假陽性率過高，因此對實驗組假陽性微小病灶的可能影響因素進行分析。將實驗組微小病灶分為陽性 （肝癌） 和假陽性 （增生、肝硬化、肝纖維化） 2組，結果顯示，不同腫瘤剖面熒光類型的假陽性存在統(tǒng)計學差異 （P＜0.05）。見表6。

3 討論

微小肝癌為早期肝癌，肝癌的早期及精準診斷是肝癌治療的重點和難點。近年來，ICG介導的近紅外分子熒光成像技術實現(xiàn)了對肝癌病灶的精準定位［18］，在肝癌的診斷以及手術定位方面表現(xiàn)突出［19-20］，為肝癌的早期診斷提供了一個新思路。

本研究主要針對肝癌早期的微小病灶，探討了在現(xiàn)有常規(guī)影像學檢查基礎上對術中離體標本進行ICG免疫熒光成像檢測的可行性。結果顯示，ICG介導的免疫熒光成像技術在發(fā)現(xiàn)微小肝癌方面，比常規(guī)影像學檢查具有更高的靈敏度和更大的潛能，能發(fā)現(xiàn)微小的肝臟腫瘤，利于預防肝癌術后早期復發(fā)；同時有助于腫瘤分期及預后判斷，可以考慮在肝臟手術中作為傳統(tǒng)影像學檢查的補充。

表6 肝臟顯影微小病灶假陽性可能相關因素分析Tab.6 Analysis of possible correlation factors for false-positive imaging findings of liver microlesions

ICG熒光成像系統(tǒng)探測深度較淺，最大深度僅1 cm，故可能有遺漏病灶尚未檢出。檢出微小病灶的病理結果假陽性率較高，現(xiàn)有研究［7，15-17，20］報道，該項探測技術針對合并肝硬化的肝癌患者檢測假陽性率可達 40%～50%，本研究患者中大部分均合并肝硬化，假陽性率達68.53%，高于文獻報道。本研究已將可能的影響因素如肝臟損傷史、肝硬化、腫瘤與微小病灶是否位于同一肝葉、主標本腫瘤熒光類型、主標本腫瘤直徑、ICGR15及ICG注射時間等進行分析，但可能由于受樣本量有限，并未顯示有明顯相關因素。

本研究結果顯示，肝癌手術中實時熒光成像探測出癌周高亮熒光顯影微小癌灶的概率與患者年齡、性別、有無肝損傷史、有無肝硬化、ICGR15、ICG注射時間、腫瘤直徑、腫瘤為原發(fā)或復發(fā)及腫瘤分化程度等因素無明顯相關性。術中探測出的高亮熒光微小病灶病理陽性率雖低，但在靈敏度方面高于常規(guī)影像學檢查，且有助于進一步明確肝癌患者的TNM分期，對診斷及治療均有一定幫助。該項檢測的Youden指數(shù)為0.361 4（＞0），說明ICG免疫熒光成像技術在檢測肝臟微小病灶方面有臨床價值。若能有大量樣本，應進一步細化各因素，進行分層探討，可能會得到更嚴謹?shù)慕Y論。

綜上所述，ICG免疫熒光探測有望成為今后肝臟手術中實時檢測小肝癌和肝臟癌前病變的常規(guī)診療技術。本研究結果顯示，ICG熒光成像技術對肝臟微小病灶的診斷具有指導意義及臨床價值，證實了肝臟腫瘤分化程度可能對ICG熒光成像診斷小肝癌灶的假陽性率有一定影響，但未能探尋出更好的減少假陽性率的具體方法。本研究為離體標本上進行，若能進一步完善，將來亦可能為肝癌的術中實時診斷及治療提供依據(jù)。